第十三章高等植物基因工程

第一節(jié)植物基因工程發(fā)展現(xiàn)狀第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選第二節(jié)植物基因工程方法第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實(shí)第五節(jié)植物基因工程應(yīng)用第十三章高等植物基因工程本文檔共67頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分第二節(jié)植物基因工程方法一、植物遺傳轉(zhuǎn)化的方法

植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為兩大類：（一）生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法操作簡(jiǎn)便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。（二）直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)包括基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。本文檔共67頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分

1、農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒與T-DNA的整合機(jī)制幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農(nóng)桿菌感染，而產(chǎn)生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質(zhì)粒介導(dǎo)的。（一）生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化本文檔共67頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分Ti質(zhì)粒（Tumorinducedplasmid）本文檔共67頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分

T-DNAT-DNA長(zhǎng)約23kb（15kb-30kb

）

，共有三套基因：AuxinCytokininOpine合成的植物生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長(zhǎng)與分裂，形成冠癭瘤。

本文檔共67頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分Ti質(zhì)粒（Tumorinducedplasmid）環(huán)狀ds-DNA,160-250kb，具六個(gè)功能區(qū)致瘤區(qū)：合成植物生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素冠癭堿合成區(qū)：參與冠癭堿合成冠癭堿分解區(qū)：參與冠癭堿分解Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)：參與在不同農(nóng)桿菌中的接合轉(zhuǎn)移毒性區(qū)（Vir）（Virulenceregion)

：直接參與T-DNA的轉(zhuǎn)移和插入植物染色體DNA復(fù)制區(qū)（Rep）：參與Ti質(zhì)粒DNA復(fù)制本文檔共67頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化分子機(jī)理整個(gè)過程分為以下6個(gè)步驟：

1）農(nóng)桿菌對(duì)受體的識(shí)別

2）農(nóng)桿菌附著到受體細(xì)胞

3）誘導(dǎo)和啟動(dòng)毒性區(qū)基因表達(dá)

4）類似接合孔復(fù)合體的合成和裝配

5）T-DNA的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)

6）T-DNA與受體基因的整合本文檔共67頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分Ti質(zhì)粒作為載體的優(yōu)點(diǎn)宿主范圍廣，能轉(zhuǎn)化所有的雙子葉植物整合到染色體上后成為染色體的正常組分永遠(yuǎn)保留冠癭堿合成酶基因啟動(dòng)子是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子本文檔共67頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分Ti質(zhì)粒的改造策略天然的Ti質(zhì)粒不能作為表達(dá)載體使用的原因：

a.

植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)素和分裂素，阻止了生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的細(xì)胞再生長(zhǎng)為整株植物，因此，必須除去生長(zhǎng)素和分裂素基因。

b.

有機(jī)堿的合成與T-DNA的轉(zhuǎn)化無關(guān)，而且會(huì)影響植物細(xì)胞生長(zhǎng)，因?yàn)橛袡C(jī)堿合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必須去除有機(jī)堿合成基因（tmt）。

c.

Ti質(zhì)粒過大，重組操作非常困難，也很難找到單一的酶切位點(diǎn)。

d.Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制。本文檔共67頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分Ti質(zhì)粒的改造為了使重組質(zhì)粒DNA的大量擴(kuò)增，添加大腸桿菌復(fù)制子；加入植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記，如neor基因（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因）；使用植物細(xì)胞啟動(dòng)子及末端polyA化信號(hào)；加入多聚人工接頭以利于外源基因的克隆。

植物中一般不存在質(zhì)粒，為利用農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒，發(fā)展了一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)，避免了在大的Ti質(zhì)粒上進(jìn)行分子重組操作的困難。

本文檔共67頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分用于植物基因轉(zhuǎn)化的Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)一元載體系統(tǒng)/共整合載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)本文檔共67頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分一元載體系統(tǒng)Transgenicplant目的基因oriSelectableMarkerGene中間載體Ti質(zhì)粒AuxinCytokininOpineL/RBorder本文檔共67頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分1、Ti質(zhì)粒進(jìn)行卸甲處理。2、將目的基因構(gòu)建于中間載體上。3、在卸甲載體T-DNA區(qū)插入一段與中間載體同源的質(zhì)粒序列。4、然后將中間載體轉(zhuǎn)移到含有卸甲載體的根癌農(nóng)桿菌中，中間載體通過同源重組整合到卸甲載體的T-DNA區(qū)，并與卸甲Ti質(zhì)粒一起復(fù)制。5、根據(jù)中間載體上所攜帶的抗性基因進(jìn)行抗性篩選，獲得遺傳重組根癌農(nóng)桿菌菌株。6、使用這種菌株去侵染植物組織細(xì)胞，就可以獲得含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植物。卸甲載體中間載體共整合系統(tǒng)（一元載體系統(tǒng)）要點(diǎn)本文檔共67頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分二元載體系統(tǒng)TransgenicplantvirorirepMCSTi質(zhì)粒AuxinCytokininOpineL/RBorder目的基因本文檔共67頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分二元載體系統(tǒng)（雙元載體系統(tǒng)）要點(diǎn)1、微型Ti質(zhì)粒缺失Vir區(qū)，T-DNA區(qū)進(jìn)行卸甲處理；2、引入多個(gè)酶切位點(diǎn)和廣譜的復(fù)制元件；3、把外源基因重組于微型Ti質(zhì)粒上；4、輔助質(zhì)粒去掉T-DNA區(qū)，Vir區(qū)仍然存在；5、把微型質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有輔助質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌中，隨后侵染植物組織；6、兩種Ti質(zhì)粒可通過反式作用將含有外源基因的T-DNA區(qū)轉(zhuǎn)移到植物組織細(xì)胞中。微型Ti質(zhì)粒輔助Ti質(zhì)粒本文檔共67頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分轉(zhuǎn)化程序（1）選擇外植體葉片、子葉、胚軸、…

選擇轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)幼期外植體最佳感受態(tài)時(shí)期外植體易于組培，再生外植體要暴露分生組織細(xì)胞，增加農(nóng)桿菌與分生組織細(xì)胞接觸面。根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一般步驟本文檔共67頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分（2）共培養(yǎng)

農(nóng)桿菌溶液接種到外植體損傷切面浸泡一段時(shí)間。然后洗掉非傷面菌液轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上共培養(yǎng)（將接種農(nóng)桿菌的外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，此時(shí)農(nóng)桿菌隨外植體的細(xì)胞分裂而繁殖并進(jìn)行侵染，T-DNA轉(zhuǎn)移整合，此過程叫共培養(yǎng)）。

本文檔共67頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分

（3）脫菌共培養(yǎng)后轉(zhuǎn)到含有殺農(nóng)桿菌抗生素的培養(yǎng)基上脫菌羧卞青霉素250mg/L

頭孢500mg/L

羧吩青霉素四環(huán)素和利福平（4）再生篩選本文檔共67頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分

2、病毒介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化植物病毒廣泛存在，而且不受單子葉或雙子葉的限制。因此病毒作為植物基因工程的載體日益受到人們的重視。在已知300種特征清楚的植物病毒中，雙鏈DNA病毒、單鏈DNA病毒各占3%。RNA不適合于作為克隆載體，因?yàn)镽NA的操作非常困難。在植物上已知有兩種DNA病毒，花椰菜花葉病毒（Cauliflowermosaicvirus,CaMV）和雙聯(lián)體病毒（geminivirus），但都不是基因克隆的理想載體。

花椰菜花葉病毒載體已用來克隆了一個(gè)基因進(jìn)入蕪箐甘藍(lán)，有兩個(gè)因素限制了其應(yīng)用：

1）花椰菜花葉病毒基因組的大小，即使是切除了非必需序列，花椰菜花葉病毒載體的承載插入片段的能力還是有限的，只能插入很小的片段。

2）花椰菜花葉病毒的寄主范圍非常窄，主要是蕓苔屬植物如蕪菁、甘藍(lán)和花椰菜等。

二價(jià)病毒可能比較有潛力，侵染重要的作物，如玉米和小麥，然而在侵染過程中，二價(jià)病毒重新排列并刪除部分序列，攪亂插入的DNA序列。這種病毒可引起破壞性的侵染，需要嚴(yán)格的防護(hù)，防止載體從寄主中逃逸侵染自然中的植物。所以花椰菜花葉病毒和二價(jià)病毒作為克隆載體還需要進(jìn)一步的改造。本文檔共67頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分（二）DNA直接轉(zhuǎn)移法農(nóng)桿菌侵染雙子葉植物獲得轉(zhuǎn)基因植株是非常成功的，但自然界中的農(nóng)桿菌只侵染雙子葉植物，對(duì)單子葉植物不敏感。雖然通過添加乙酰丁香酮類物質(zhì)可使農(nóng)桿菌侵染單子葉植物，但單子葉植物的再生比較困難，因而農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物仍然是比較困難的。

1984年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，超螺旋結(jié)構(gòu)的細(xì)菌質(zhì)粒，雖然不能在植物細(xì)胞中復(fù)制，但可以重組整合到植物染色體內(nèi)。受這一現(xiàn)象的啟發(fā)產(chǎn)生基因直接轉(zhuǎn)移技術(shù)。重組機(jī)制并不清楚，因?yàn)榧?xì)菌質(zhì)粒與植物DNA之間沒有同源性，事實(shí)上整合是隨機(jī)發(fā)生在植物染色體的任何位點(diǎn)。本文檔共67頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分DNA直接轉(zhuǎn)移法基因槍法原生質(zhì)體法脂質(zhì)體法花粉管通道法電激轉(zhuǎn)化法PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等。本文檔共67頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分1.基因槍法本文檔共67頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分（1）定義基因槍法（particlegun）又稱微彈轟擊法（microprojectilebombardment,particlebombardment,biolistic)。它是把遺傳物質(zhì)或其它物質(zhì)附著于高速微彈上直接射入組織、細(xì)胞、細(xì)胞器內(nèi)，完成整合并表達(dá)的基因轉(zhuǎn)化的方法。最早是由Cornell大學(xué)研制的火藥基因槍。1990年，美國(guó)杜邦公司推出了商品基因槍PDS-1000系統(tǒng)。基因槍的組成部分由點(diǎn)火裝置、發(fā)射裝置、擋板、樣品室、真空系統(tǒng)組成。本文檔共67頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分（2）動(dòng)力系統(tǒng)炸藥爆破力gunpower

高壓氣體（highpressuregas）高壓放電（3）DNA顆粒載體的制備利用CaCl2對(duì)DNA沉淀作用；亞精氨、PEG的粘附等作用將DNA固定在顆粒表面。本文檔共67頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分（4）金屬顆粒

金粉：規(guī)則的球形，比表面積大，DNA吸附力強(qiáng)

鎢粉：廉價(jià)，易得，但易在細(xì)胞表面形成有害的氧化物本文檔共67頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分基因槍轉(zhuǎn)化率

基因槍轉(zhuǎn)化率差異很大，一般在10-3~10-2之間。McCabe在大豆上高達(dá)2%，而有的報(bào)道僅有10-4。相對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率要低得多，而且基因槍轉(zhuǎn)化成本高；嵌合體比率大、遺傳穩(wěn)定性差。本文檔共67頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分盡管基因槍法有很多缺陷，但在單子葉植物上也有廣泛應(yīng)用，優(yōu)點(diǎn)有：

a)無宿主限制，無論是單子葉植物和雙子葉植物都可以應(yīng)用。

b)受體類型廣泛，原生質(zhì)體、葉圓片、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖、根、以及種子的胚、分省組織、愈傷組織、花粉細(xì)胞、子房等幾乎所有具有分生潛力的組織或細(xì)胞都可以用基因槍進(jìn)行轟擊。

c)可控度高，商品化的基因槍都可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)控微彈的速度和射入濃度，命中特定層次的細(xì)胞。

d)操作簡(jiǎn)便迅速。

正因?yàn)榛驑屵@些優(yōu)點(diǎn)，使基因槍成功的應(yīng)用于：植物基因轉(zhuǎn)化，特別是單子葉植物的轉(zhuǎn)化；外源基因?qū)胫参锛?xì)胞器；種質(zhì)轉(zhuǎn)化（莖尖分生組織、配子體、胚胎細(xì)胞）；植物基因表達(dá)調(diào)控研究。本文檔共67頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分2.多聚物介導(dǎo)轉(zhuǎn)化：利用多聚物PEG、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等在二價(jià)陽離子作用下，促進(jìn)DNA在原生質(zhì)體表面形成沉淀，繼而通過原生質(zhì)體的內(nèi)吞噬作用而被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。多聚物促進(jìn)細(xì)胞融合的原理：多聚物使細(xì)胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促進(jìn)相互間的接觸和粘連，在細(xì)胞融合的過程中，DNA進(jìn)入細(xì)胞。本文檔共67頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分磷脂介導(dǎo)（Phospholipidsasgene-deliveryvehicles）脂質(zhì)體(liposomes)是一種人造的脂質(zhì)小泡，外周是脂雙層，內(nèi)部是水腔。本文檔共67頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分3.電穿孔法將高濃度的質(zhì)粒DNA加入到植物細(xì)胞的原生質(zhì)體懸浮液中，混合物在200-600V/cm的電場(chǎng)中處理若干秒鐘，然后將原生質(zhì)體在組織培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2周，再生出整株植物。本文檔共67頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分（1）定義：利用顯微注射儀通過機(jī)械方法將DNA注入細(xì)胞質(zhì)或核內(nèi)。4.顯微注射法（microinjection):本文檔共67頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分（2）細(xì)胞固定（對(duì)植物來言）：瓊脂糖包埋法多聚賴氨酸粘連吸管支持法（3）優(yōu)缺點(diǎn)：轉(zhuǎn)化率高，10-20%甚至60%

繁瑣耗時(shí)，需要專門的顯微注射儀，要求精密操作技術(shù)和低密度培養(yǎng)技術(shù)。本文檔共67頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分

5、花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。該方法于80年代初期由我國(guó)學(xué)者周光宇提出，我國(guó)目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握。

利用花粉管通道將DNA轉(zhuǎn)移至胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具正常細(xì)胞壁的卵、合子及早期的胚胎組織。目前已應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的轉(zhuǎn)基因研究。

本文檔共67頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分第三節(jié)轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的篩選采用某種轉(zhuǎn)基因方法處理外植體后，通常外植體中僅有少數(shù)細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)化。只有采取有效的篩選方法，才能高效準(zhǔn)確地選擇到轉(zhuǎn)化細(xì)胞。篩選方法主要有兩種：

解毒基因篩選選擇基因?yàn)橐唤舛净颍梢韵囵B(yǎng)基中有害物質(zhì)（如抗生素、除草劑等）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用；而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能在含有有害物質(zhì)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選受體細(xì)胞為營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞，不能在選擇性培養(yǎng)基中增殖，而選擇基因可以補(bǔ)償這種缺陷，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。本文檔共67頁；當(dāng)前第34頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分一、植物基因工程中的選擇基因植物基因工程中的選擇標(biāo)記基因主要是一類編碼可使抗生素或除草劑失活的蛋白酶基因。1、新霉素抗性基因（neor）2、慶大霉素抗性基因（gentr）3、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）4、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）本文檔共67頁；當(dāng)前第35頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分1、新霉素抗性基因（Neomycinephosphotransferase–II,NPT-II，neor

）由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn5中分離。選擇試劑：卡那霉素、新霉素、G418（氨基糖苷類抗生素）。neor可使選擇試劑磷酸化而失效（即催化ATP上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到諸如新霉素、卡那霉素、慶大霉素和G418等抗生素分子的某些基團(tuán)上。）。該類抗生素通過干擾70s核糖體的功能抑制蛋白質(zhì)合成，阻礙了原核生物蛋白質(zhì)的合成。對(duì)植物細(xì)胞的毒性機(jī)理是通過干擾植物細(xì)胞葉綠體、線粒體中核糖體的功能而抑制葉綠體和線粒體蛋白質(zhì)的合成。該基因廣泛應(yīng)用于雙子葉植物，單子葉中也有成功應(yīng)用。本文檔共67頁；當(dāng)前第36頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分2、慶大霉素抗性基因（gentr）gentr編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶。選擇試劑：慶大霉素。gentr編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶可使慶大霉素乙酰化而失活。該基因在矮牽牛、煙草和番茄轉(zhuǎn)基因篩選中有較廣泛應(yīng)用。本文檔共67頁；當(dāng)前第37頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分3、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt）潮霉素是一種很強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，對(duì)許多植物都有毒性。選擇試劑：潮霉素。hpt可使選擇試劑磷酸化而失活。該基因廣泛應(yīng)用于單子葉植物，特別是水稻的轉(zhuǎn)基因研究，是一種選擇效率很高的選擇基因。本文檔共67頁；當(dāng)前第38頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分4、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（bar）由吸水鏈霉菌中克隆。選擇試劑：膦絲菌素（basta)。膦絲菌素可抑制谷氨酰胺合成酶活性，從而導(dǎo)致非轉(zhuǎn)化細(xì)胞氨的致死性積累。Bar編碼的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶可使膦絲菌素乙酰化而失活。該基因廣泛應(yīng)用于禾谷類作物以及大豆、油菜等油料作物的轉(zhuǎn)基因研究。本文檔共67頁；當(dāng)前第39頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分報(bào)告基因是指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測(cè)定、常用于盤底外源基因是否成功地導(dǎo)入受體細(xì)胞（器官或組織），是否啟動(dòng)表達(dá)的一類特殊用途基因。報(bào)告基因與選擇基因的區(qū)別在于：二、植物基因工程中的報(bào)告基因選擇基因往往需要與外界的篩選壓力如抗生素等相互作用，以篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞；二報(bào)告基因的應(yīng)用不需要外界選擇壓力的存在。本文檔共67頁；當(dāng)前第40頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分理想報(bào)告基因應(yīng)具備的條件1、受體細(xì)胞不存在相應(yīng)的內(nèi)源等位基因活性；2、它的產(chǎn)物是唯一的，且不會(huì)損害受體細(xì)胞；3、具有檢測(cè)快速、靈敏、價(jià)廉且可定量、重復(fù)測(cè)定特性。本文檔共67頁；當(dāng)前第41頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分目前常用報(bào)告基因1、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）2、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）3、

熒光素酶基因（

luc）4、綠色熒光蛋白基因

（gfp）本文檔共67頁；當(dāng)前第42頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分1、β-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因存在于某些細(xì)菌體內(nèi)。編碼β-葡萄糖苷酸酶。檢測(cè)的底物有3種，

1）X-gluc5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷、5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-b-D-glucuronide；

2）PNPG

對(duì)硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、p-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside。

3）4-MUG

4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸、4-methylumbelliferyl?-D-glucuronide本文檔共67頁；當(dāng)前第43頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分X-gluc5，5’-二溴-4，4’-二氯靛藍(lán)（藍(lán)色，顯色）

(5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸)4-MUG

4-甲基傘形酮（熒光物質(zhì)）＋β-D-葡萄糖醛酸（4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸）熒光，熒光分光光度計(jì)PNPG對(duì)硝基苯酚（溶液呈黃色，PH=7.15，400~420nm）（4-甲基傘形酮酰-β-D-葡萄糖醛酸）分光光度計(jì)GUSGUS（1）GUS基因的檢測(cè)十分簡(jiǎn)單、方便和靈敏。（2）絕大多數(shù)植物中沒有檢測(cè)到該酶的背景活性。（3）GUS基因還可用來進(jìn)行嵌合基因的構(gòu)建和分析。優(yōu)點(diǎn)：GUS本文檔共67頁；當(dāng)前第44頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分2、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因

cat基因是由大腸桿菌易位子Tn9所編碼的，它可以催化乙酰CoA轉(zhuǎn)乙?；铰让顾胤肿?導(dǎo)致氯霉素分子發(fā)生乙?；饔茫瑥亩セ钚?。真核生物無該基因，無該酶內(nèi)源活性。該酶活性可以通過反應(yīng)底物乙酰CoA的減少或反應(yīng)產(chǎn)物還原型乙酰CoA的生成來測(cè)定，目前常用的方法有硅膠G薄層層析法及DTNB分光光度法。

CAT1—乙酰氯霉素

CoA＋氯霉素2—乙酰氯霉素（氯霉素失效）

3—乙酰氯霉素優(yōu)點(diǎn)：克服了受體細(xì)胞非特異性酶本底較高的缺點(diǎn)，且CAT酶定量分析準(zhǔn)確。本文檔共67頁；當(dāng)前第45頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分3、熒光素酶（LUC）基因

來源：從北美熒光蟲和叩頭蟲的cDNA文庫(kù)中克隆出來的。功能：luc基因所編碼的熒光素酶是生物體催化自身發(fā)光的一種蛋白。該酶在有ATP、Mg2+、O2和熒光素存在的條件下可發(fā)射出熒光，熒光持續(xù)數(shù)秒到數(shù)分鐘即消失，可用微光測(cè)定儀檢測(cè)到非常微弱的熒光素酶分子。熒光光度計(jì)（1）LUC測(cè)定靈敏度非常高（2）LUC檢測(cè)法成本低（3）免于放射性同位素檢測(cè)對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境所造成的危害。（4）該酶的活性不需要轉(zhuǎn)錄后修飾，可以在幾乎所有的宿主細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)點(diǎn)：插入了螢火蟲熒光素酶基因的煙草,由于熒光素酶基因的表達(dá)使得煙草發(fā)光.本文檔共67頁；當(dāng)前第46頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分4、綠色熒光蛋白（GFP）基因

來源：海洋生物水母，其基因可在異源組織中表達(dá)并產(chǎn)生熒光。功能：gfp

開放閱讀框架長(zhǎng)度約740bp，編碼238個(gè)氨基酸殘基，其肽鏈內(nèi)部第65～67位絲氨酸-脫氫酪氨酸-甘氨酸通過自身環(huán)化和氧化形成一個(gè)發(fā)色基團(tuán)，在長(zhǎng)紫外波或藍(lán)光照射下發(fā)出綠色熒光。檢測(cè)：可在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀中直接觀察基因的表達(dá)。GreenFluorescentProtein(GFP)本文檔共67頁；當(dāng)前第47頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分外源基因是否整合到染色體上？整合方式如何？整合到染色體上的外源基因是否表達(dá)？基因表達(dá)是否產(chǎn)生了完整的蛋白質(zhì)？是否產(chǎn)生了目的性狀？

需要通過以下鑒定與證實(shí)分子生物學(xué)鑒定表型鑒定遺傳學(xué)鑒定第四節(jié)轉(zhuǎn)化體的鑒定與證實(shí)本文檔共67頁；當(dāng)前第48頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分外源基因轉(zhuǎn)化驗(yàn)證內(nèi)容和技術(shù)外源基因是否整合

PCR技術(shù)(需要注意假陽性問題、外源基因仍有可能以游離形式存在問題)Southern雜交外源基因表達(dá)

RT-PCR技術(shù)(假陽性問題)Northern雜交

Western雜交本文檔共67頁；當(dāng)前第49頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分第五節(jié)植物基因工程應(yīng)用本文檔共67頁；當(dāng)前第50頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分轉(zhuǎn)基因作物

抗病蟲害抗非生物脅迫(逆境)提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)花卉植物基因工程植物醫(yī)藥基因工程本文檔共67頁；當(dāng)前第51頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分一、抗性基因工程抗病蟲害抗非生物脅迫(逆境)本文檔共67頁；當(dāng)前第52頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分抗植物病蟲害基因的應(yīng)用抗蟲基因Bt基因蛋白酶抑制基因植物凝集素基因淀粉酶抑制劑基因毒素蛋白基因（Bt）本文檔共67頁；當(dāng)前第53頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分Bt基因抗蟲應(yīng)用i.來源：蘇云金桿菌（Bacillusthuringiensis,Bt）在形成芽孢的過程中，產(chǎn)生具有高度特異性殺蟲活性的殺蟲結(jié)晶蛋白（insecticidalcrystalprotein,ICP）ii.原理：死亡ICP原毒素昆蟲停止進(jìn)食細(xì)胞滲透平衡破壞形成細(xì)胞膜孔道與腸道上皮細(xì)胞上特異性蛋白結(jié)合毒性多肽ICP在昆蟲堿性腸道內(nèi)活化昆蟲取食本文檔共67頁；當(dāng)前第54頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分抗植物抗毒病基因的應(yīng)用抗病毒基因cp基因（病毒外殼蛋白基因）病毒復(fù)制酶基因反義RNA介導(dǎo)抗病毒缺陷型運(yùn)動(dòng)蛋白介導(dǎo)抗病毒植物體內(nèi)的抗病毒基因缺陷干擾顆?？共《竞颂求w失活蛋白基因干擾素基因病毒衛(wèi)星RNA本文檔共67頁；當(dāng)前第55頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分抗植物真菌病害基因的應(yīng)用植物病原菌致病小種進(jìn)化相對(duì)較快植物對(duì)病原菌的抗性機(jī)理不十分清楚抗病原菌基因抗病基因，如水稻白葉枯病抗性基因解毒酶類基因抗菌肽及抗菌蛋白基因，如溶菌酶基因病程相關(guān)蛋白類基因，如幾丁質(zhì)酶基因活性氧類基因植保素類基因本文檔共67頁；當(dāng)前第56頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分抗植物非生物脅迫基因的應(yīng)用非生物脅迫的種類溫度:凍害,冷害,高溫風(fēng),雷,電等化學(xué)因素:鹽類,離子,氣體,除草劑輻射水:澇,干旱本文檔共67頁；當(dāng)前第57頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分抗其他植物非生物脅迫基因的應(yīng)用合成滲透壓調(diào)節(jié)物的關(guān)鍵性酶，如脯氨酸合成酶等－－抗鹽堿、抗旱具解毒作用的酶，如超氧化物歧化酶，SOD－－抗干旱引起的氧化作用保護(hù)生物大分子及膜結(jié)構(gòu)的酶，AFP－－抗凍，抗寒，抗旱保護(hù)作用蛋白酶，巰基蛋白酶第一類：直接作用本文檔共67頁；當(dāng)前第58頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分抗其他植物非生物脅迫基因的應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子，DREB－－對(duì)干旱、低溫、高鹽脅迫作出反應(yīng)蛋白激酶，MAP－－逆境表達(dá)與第二信使有關(guān)的酶類，如磷酯酶第二類：應(yīng)激調(diào)節(jié)與信號(hào)傳導(dǎo)本文檔共67頁；當(dāng)前第59頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分抗除草劑的基因工程策略1.修飾除草劑作用的靶蛋白,使其對(duì)除草劑不敏感或過量表達(dá)使其植物吸收后仍能進(jìn)行正常代謝;2.引入酶或酶系統(tǒng),在除草劑發(fā)生作用前將其降解或解毒.本文檔共67頁；當(dāng)前第60頁；編輯于星期三\14點(diǎn)6分抗除草劑的基因工程靶蛋白抗性基因