基因芯片技術(shù)

關(guān)于基因芯片技術(shù)第1頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三生物芯片是八十年代末在生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)高新技術(shù)，它主要是指通過微加工技術(shù)和微電子技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、DNA以及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。第2頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三世界著名商業(yè)雜志《財(cái)富》對基因生物芯片領(lǐng)域非?？春?，它在其1997年的3月31刊中講到：“微處理器使我們的經(jīng)濟(jì)發(fā)生了根本改變、給人類帶來了巨大的財(cái)富、改變了我們的生活方式。然而，生物芯片給人類帶來的影響可能會(huì)更大…...”第3頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三酵母全基因組基因芯片第4頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第一節(jié)生物芯片簡介1.1生物芯片的定義

生物芯片是指通過機(jī)器人自動(dòng)印跡或光引導(dǎo)化學(xué)合成技術(shù)在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列，根據(jù)分子間的特異性相互作用的原理，將生命科學(xué)領(lǐng)域中不連續(xù)的分析過程集成于芯片表面，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準(zhǔn)確、快速、大信息量的檢測。第5頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因芯片——又稱DNA芯片或DNA陣列，是生物芯片的一種類型，它是將DNA分子固定于支持物上，并與標(biāo)記的樣品雜交，通過自動(dòng)化儀器檢測雜交信號的強(qiáng)度來判斷樣品中靶分子的數(shù)量，進(jìn)而得知樣品中mRNA的表達(dá)量，也可以進(jìn)行基因突變體的檢測和基因序列的測定。第6頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三1.2基因芯片分析流程

基因芯片分析的過程主要包括樣品及其標(biāo)記處理、芯片制作、分子雜交、信號的檢測和數(shù)據(jù)處理及分析等幾個(gè)步驟?；蛐酒睦碚摶A(chǔ)：傳統(tǒng)的Southernblot和Northernblot是將受檢測的樣本固定在尼龍膜上，再利用特定的已知探針來檢測樣本中是否存在互補(bǔ)的DNA序列?；蛐酒暮诵脑砼cSouthernblot和Northernblot相同，只是相反將各種探針固化到基質(zhì)上，用以檢測受檢樣品中與各種探針互補(bǔ)的核酸物質(zhì)的變化。第7頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第8頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三1樣品制備2DNA提取3熒光標(biāo)記4分子雜交5信號檢測6點(diǎn)陣分析第9頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三1.3基因芯片技術(shù)的特點(diǎn)1、基因芯片的優(yōu)點(diǎn)1）高通量性：可同時(shí)并行分析成千上萬種分子。節(jié)省時(shí)間，并減少系統(tǒng)誤差。2）微型化3）高度自動(dòng)化4）結(jié)果重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性更高（基因芯片能在同一張芯片上同時(shí)對實(shí)驗(yàn)組和對照組材料進(jìn)行雜交分析，這樣就實(shí)現(xiàn)了平行化操作，避免了各種誤差，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性）第10頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三2、基因芯片的缺點(diǎn)

基因芯片技術(shù)體系的建立和使用需要較大的投入。（但是，相對于傳統(tǒng)的表達(dá)分析技術(shù)而言，單個(gè)基因分析的成本仍是較低的。）第11頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第12頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第二節(jié)生物芯片的分類2.1按載體材料分類

玻璃芯片硅芯片陶瓷芯片

玻璃芯片具有易得、熒光背景低、應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，目前在國際上廣泛使用。

第13頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三2.2按點(diǎn)樣方式分類1、原位合成芯片（將半導(dǎo)體中的光蝕刻技術(shù)運(yùn)用到DNA合成化學(xué)中，以單核苷酸或其他分子大分子為底物，在玻璃晶片上原位合成寡核苷酸）2、微矩陣芯片（目前應(yīng)用最廣泛的基因芯片之一。具有高密度、制作簡便的特點(diǎn)。其是將用PCR或化學(xué)合成等方法得到的DNA或寡核苷酸片段用針點(diǎn)或噴點(diǎn)的方法直接排列到玻片等載體上，從而制備成芯片。）3、電定位芯片（利用靜電吸附的原理將DNA快速定位在硅基質(zhì)、導(dǎo)電玻璃上。）第14頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三2.3按芯片固定的生物分子類型分類（1）基因芯片或DNA芯片（2）蛋白質(zhì)芯片（3）芯片實(shí)驗(yàn)室（lab-on-chip）

將一個(gè)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)步驟微縮于一個(gè)芯片上芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-chip）或稱微全分析系統(tǒng)（MiniaturizedTotalAnalysisSystem,μ-TAS）是指把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、生物與化學(xué)反應(yīng)、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學(xué)反應(yīng)過程，并對其產(chǎn)物進(jìn)行分析的一種技術(shù)。第15頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三芯片實(shí)驗(yàn)室的特點(diǎn):其一、集成性。目前一個(gè)重要的趨勢是：集成的單元部件越來越多，且集成的規(guī)模也越來越大。所涉及到的部件包括：和進(jìn)樣及樣品處理有關(guān)的透析、膜、固相萃取、凈化；用于流體控制的微閥（包括主動(dòng)閥和被動(dòng)閥），微泵（包括機(jī)械泵和非機(jī)械泵）；微混合器，微反應(yīng)器，另外還有微通道和微檢測器等。

其二、分析速度極快。Mathies研究小組在一個(gè)半徑僅為8厘米長的園盤上集成了384個(gè)通道的電泳芯片。他們在325秒內(nèi)檢測了384份與血色病連鎖的H63D突變株（在人HFE基因上）樣品，每個(gè)樣品分析時(shí)間不到一秒鐘。

其三、高通量。

其四、能耗低，物耗少，污染小。每個(gè)分析樣品所消耗的試劑僅幾微升至幾十個(gè)微升，被分析的物質(zhì)的體積只需納升級或皮升級。其五、廉價(jià)，安全。無論是化學(xué)反應(yīng)芯片還是分析芯片由于上述特點(diǎn)隨著技術(shù)上的成熟，其價(jià)格將會(huì)越來越廉價(jià)。針對化學(xué)反應(yīng)芯片而言，由于化學(xué)反應(yīng)在微小的空間中進(jìn)行，反應(yīng)體積小，分子數(shù)量少，反應(yīng)產(chǎn)熱少，又因反應(yīng)空間體表面積大，傳質(zhì)和傳熱的過程很快，所以比常規(guī)化學(xué)反應(yīng)更安全。第16頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三2.4按芯片使用功能分類

（1）測序芯片（2）表達(dá)譜芯片（3）基因差異表達(dá)分析芯片第17頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三一組寡核苷酸探針—TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交探針組TATGCAATCTAG重組的互補(bǔ)序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC

ATACGTTA測序芯片第18頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因表達(dá)譜芯片第19頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因差異表達(dá)分析芯片第20頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第三節(jié)基因芯片的制作固相介質(zhì)

硅片、二氧化硅、玻璃、尼龍膜、塑料等。靶片段

DNA、寡核苷酸、RNA等。探針

mRNA，或是以mRNA為模板合成的cDNA。標(biāo)記物常采用熒光劑（如Cy3、Cy5）；同位素等。第21頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三3.1用于芯片制作的DNA樣品的來源

（1）從細(xì)胞或組織中提取mRNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA文庫，經(jīng)測序及生物信息學(xué)分析得到代表各個(gè)基因的DNA序列，用PCR擴(kuò)增技術(shù)或DNA固相結(jié)合技術(shù)來獲取人們所期望的各種基因片段；（2）利用基因組測序數(shù)據(jù)，經(jīng)生物信息學(xué)分析得到代表各個(gè)基因的數(shù)據(jù)，在利用PCR技術(shù)或DNA固相結(jié)合技術(shù)來獲取人們所期望的各種基因片段。第22頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三3.2生物芯片的制作方法

生物芯片微陣列的制作技術(shù)按照制作方法可分為：原位合成和預(yù)合成后點(diǎn)樣。

原位合成法是由點(diǎn)樣系統(tǒng)將探針的組成部分逐步轉(zhuǎn)移到基體上，同時(shí)實(shí)現(xiàn)探針合成和轉(zhuǎn)移的目的。

預(yù)合成后點(diǎn)樣是指制備芯片微陣列前，要固定的探針已經(jīng)合成好，點(diǎn)樣系統(tǒng)需要做的就是把這些合成好的樣品涂印或噴涂在基體上。第23頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三1、原位合成光刻DNA合成法（將半導(dǎo)體工業(yè)中的光刻技術(shù)和DNA化學(xué)合成相結(jié)合，把光不穩(wěn)定保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的4種DNA模塊固定在玻片上，通過光脫保護(hù)，用少量的保護(hù)寡核苷酸和試劑按照設(shè)計(jì)的序列進(jìn)行DNA合成。）

優(yōu)點(diǎn)：合成的密度和精度優(yōu)于后兩種方法。

缺點(diǎn)：需要花費(fèi)大量的時(shí)間去設(shè)計(jì)和制造價(jià)格很高的照相掩蔽網(wǎng)。第24頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三1通過光刻掩膜曝光2去保護(hù)區(qū)域被激活3固相化合成1個(gè)堿基4通過另一個(gè)光刻掩膜曝光5引入另一個(gè)堿基6重復(fù)這一步驟第25頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三2、預(yù)合成后點(diǎn)樣（1）接觸點(diǎn)樣法（將樣品直接點(diǎn)在基體上）

優(yōu)點(diǎn)：儀器結(jié)構(gòu)簡單、容易研制，是一種快速、經(jīng)濟(jì)、多功能的儀器。

缺點(diǎn)：每個(gè)樣品都必須是合成好、經(jīng)過純化、事先保存的。第26頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三2202芯片點(diǎn)樣儀

生產(chǎn)商Bio-Rad

性能介紹分辨率：1.25um(x，y軸)和0.25um(Z軸)，重復(fù)性：3um

球面精確性：l0um。

一次制成芯片數(shù)：126塊芯片每塊玻片點(diǎn)樣量>82,000個(gè)點(diǎn)

第27頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第28頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三（2）噴墨法（通過壓電晶體或其他推進(jìn)式從很小的噴嘴內(nèi)把生物樣品噴射到玻璃載體上。）該法所需的樣品都必須是合成好的純樣品（cDNA、染色體DNA和抗體）。與接觸點(diǎn)樣法不同之處在于噴嘴不與芯片接觸。第29頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三點(diǎn)樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA（或寡核苷酸）探針庫，然后通過特殊的針頭和微噴頭,分別把不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底表面上不同位點(diǎn),并通過物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。玻璃基質(zhì)第30頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因芯片微點(diǎn)陣制備系統(tǒng)第31頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三3.3DNA分子在剛性表面的固定制作生物芯片的載體材料必須符合下列要求：（1）載體表面必須適應(yīng)透射或反射光的測量；（2）使單位載體上結(jié)合的生物分子達(dá)到最佳容量；（3）載體應(yīng)當(dāng)是惰性的和有足夠的穩(wěn)定性。第32頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因芯片制作的關(guān)鍵就是如何將大量的探針分子固定于支持物上，并保持探針分子的構(gòu)像處于自然狀態(tài)，使探針DNA分子能自由地與樣品分子進(jìn)行雜交。第33頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第34頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第35頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第四節(jié)基因芯片的雜交及結(jié)果分析4.1探針的標(biāo)記

標(biāo)記的方法通常是在反轉(zhuǎn)錄的底物中加入帶有標(biāo)記基團(tuán)的寡核苷酸單體，通過反轉(zhuǎn)錄將標(biāo)記分子滲入cDNA分子中。

mRNA反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記方法直接影響DNA芯片分析結(jié)果的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性。第36頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第37頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第38頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第39頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三4.2雜交

在一定條件下，分子間氫鍵的斷裂與恢復(fù)是DNA/DNA、DNA/RNA分子間選擇性結(jié)合的根本動(dòng)力，這一過程稱之為雜交。

第40頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三與經(jīng)典分子雜交的區(qū)別：雜交時(shí)間短，30分鐘內(nèi)完成可同時(shí)平行檢測許多基因序列影響雜交反應(yīng)的因素：靶分子濃度、探針濃度、靶分子和探針的序列組成、鹽濃度及雜交溫度和時(shí)間等。第41頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三4.3芯片結(jié)果讀取與掃描儀生物芯片的掃讀（掃描）是指將與目的DNA（或RNA）雜交后、或與目的抗原、抗體、或受體等目的靶分子反應(yīng)結(jié)合后的生物芯片上成千上萬個(gè)點(diǎn)陣的生物反應(yīng)結(jié)果閱讀出來，轉(zhuǎn)變成為可供計(jì)算機(jī)處理的數(shù)據(jù)。熒光標(biāo)記的生物芯片掃描儀按其原理與結(jié)構(gòu)可以分為激光系統(tǒng)掃描儀和CCD系統(tǒng)掃描儀。第42頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因芯片雜交結(jié)果要用專用的掃描系統(tǒng)讀取。BBACDE放大器數(shù)模轉(zhuǎn)換器計(jì)算機(jī)A:激光器B:濾光片C:二色鏡D:反光鏡E:關(guān)柵

第43頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因芯片掃描結(jié)果不同的顏色代表一個(gè)探針點(diǎn)雜交上的帶熒光標(biāo)記的核酸分子數(shù)的差異。紅〉黃〉綠〉蘭〉紫第44頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因芯片熒光偵測儀

高密度微點(diǎn)陣檢測掃描系統(tǒng)第45頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三高密度微點(diǎn)陣分析軟件

圖象分析系統(tǒng)第46頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三4.4生物芯片的軟件系統(tǒng)與數(shù)據(jù)處理

當(dāng)從芯片發(fā)出的熒光轉(zhuǎn)換成數(shù)字輸出后，數(shù)據(jù)文件就被定量和翻譯，通過重疊芯片像線柵，軟件對芯片上的每個(gè)點(diǎn)計(jì)算平均密度值，從而完成定量，通過對芯片上實(shí)驗(yàn)點(diǎn)和對照點(diǎn)的比較，選出雜交點(diǎn)，并定量。第47頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三

一個(gè)完整的生物芯片配套軟件應(yīng)該包括生物芯片掃描儀的硬件控制軟件、生物芯片的圖像處理軟件和數(shù)據(jù)提取或統(tǒng)計(jì)分析軟件，以及芯片表達(dá)基因的國際互聯(lián)網(wǎng)上檢索和表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫分析和積累。第48頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三第五節(jié)基因芯片的應(yīng)用1、基因表達(dá)分析2、基因型及多態(tài)性分析3、雜交測序4、核酸和蛋白質(zhì)相互作用的研究5、疾病的診斷與治療6、藥物開發(fā)7、在營養(yǎng)與食品衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用8、在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用第49頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三基因芯片在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用一、基因芯片可應(yīng)用于疾病診斷1）腫瘤的基因診斷

例：Affymetrix公司，把P53基因全長序列和已知突變的探針集成在芯片上，制成P53基因芯片，將在癌癥早期診斷中發(fā)揮作用。2）用于診斷遺傳性疾病例：上海聯(lián)合基因公司開發(fā)了β-地中海性貧血的檢測芯片第50頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三3）用于病原體的檢出和確定例：西安聯(lián)爾公司開發(fā)了呼吸道病原體診斷芯片，可檢出多種引起呼吸道感染的病原體。二、用于組織配型例：上海復(fù)旦長江生物醫(yī)藥股份有限公司開發(fā)了HLA分型芯片，目前已在國內(nèi)各大血站投入應(yīng)用。三、藥物研究第51頁，講稿共56頁，2023年5月2日，星期三檢測與疾病相關(guān)的基因,