反相高效液相色譜法測(cè)定清益康乳膏中苦參堿的含量

反相高效液相色譜法測(cè)定清益康乳膏中苦參堿的含量【摘要】目的通過(guò)反相高效液相色譜法建立清益乳膏中苦參堿的含量測(cè)定方法。方法依利特SinoChromODSBP柱，流動(dòng)相為乙腈mol/LKH2PO4溶液mol/L十二烷基硫酸鈉，流速：ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。結(jié)果苦參堿在～μg·ml-1呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，在清益康乳膏中的平均回收率為%，RSD為%。結(jié)論該法靈敏、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可作為清益康乳膏的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】清益康乳膏；苦參堿；反相高效液相色譜；含量測(cè)定

Abstract：ObjectiveToestablishanassayofmatrineinQingyikangCreamsbyODS-BP(416mm×250mm,5μm)analyticalcolumnwasused.ThemobilephaseconsistedofAcetonitrilemol/Lmol/LSodiumDodeeyLSulfate9(20∶40∶40).Thedetectionwavelengthwas210calibrationcurveswerelinearbetween～mg·L-1(r=8).TheaveragerecoveriesofmatrineinQingyikangCreamswere%.RSDwere%(n=6).ConclusionThemethodissimple,rapid,accurateandissuitableforthedeterminationofQingykangCreams.

Keywords：QingyikangCreams;Matrine;RPHPLC;Determination

清益康乳膏由蜂膠、苦參等4味中藥制成，具有清利濕熱、止痛解毒的功效，外用主要治療帶狀皰疹等皮膚科疾病。該方原為酊劑，但由于使用不方便，且對(duì)皮膚有一定的刺激性，后改制成o/w型的乳膏。文中主要將乳膏中的主要活性成分苦參堿［1］作為主要的含測(cè)指標(biāo)。因此本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相法來(lái)測(cè)定制劑中苦參堿的含量，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)方法系統(tǒng)適應(yīng)性強(qiáng)，能準(zhǔn)確、快速，有效的控制產(chǎn)品質(zhì)量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1器材

儀器日本島津LC10AT高效液相色譜儀，SPD-10A檢測(cè)器，A4800色譜工作站，7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥。微孔濾膜，PHS25型精密pH計(jì)，HS3120型聲波清洗器，Elix/純水系統(tǒng)。

試劑乙腈為進(jìn)口色譜純；苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品；中性氧化鋁；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純規(guī)格。藥材除蜂膠propolis購(gòu)自云南昆明嵩明養(yǎng)蜂廠外，其余均購(gòu)自重慶市藥材公司。乳膏樣品與陰性樣品均為自制。

2方法與結(jié)果

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：依利特SinoChromODSBP柱，流動(dòng)相為乙腈mol/LKH2PO4溶液-mol/L十二烷基硫酸鈉［2］，流速：ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，理論塔板數(shù)按苦參堿峰計(jì)算，應(yīng)不低于3000；柱溫為30℃。流動(dòng)相臨用前以微孔濾膜過(guò)濾并經(jīng)超聲脫氣處理。

其分離色譜見(jiàn)圖1。在此條件下，供試品中苦參峰與其他峰能達(dá)到基線分離，苦參堿色譜峰的保留時(shí)間約為10min。

a對(duì)照品b清益康乳膏c陰性對(duì)照1.苦參堿

圖1色譜圖

對(duì)照品溶液的制備取110℃干燥至恒重的苦參堿對(duì)照品，精密稱取苦參堿5mg，置5ml量瓶中，加無(wú)水乙醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備取清益康乳膏g，精密稱定，加甲醇20ml，加熱回流15min至冷，濾過(guò)，濾液蒸干后用25ml氯仿液分3次洗脫，收集洗脫液，加入濃氨水ml，混勻，密塞，穩(wěn)定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量。用氯仿補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10ml，通過(guò)中性氧化鋁柱，依次以氯仿，氯仿-甲醇各20ml洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取苦參堿對(duì)照品溶液，，，，，ml置5ml量瓶中，用無(wú)水乙醇定容至刻度，搖勻。取上述溶液10μl進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。3次所得平均峰面積積分值與相應(yīng)的苦參堿對(duì)照品進(jìn)樣量之間的回歸方程為A=1298810X+4，r=8?？鄥A進(jìn)樣量在40～200μg·ml-1范圍內(nèi)與峰面積分值成線性關(guān)系。

精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取苦參堿對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定苦參堿峰面積，其RSD為%。

重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)樣品，分別稱取5份，按上述供試品溶液的制備及色譜條件，依法測(cè)定苦參堿的含量。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

加樣回收率采用加樣回收法。精密取苦參堿對(duì)照品各適量，分別加入已知苦參堿含量的樣品中，按上述“”項(xiàng)下制成供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2苦參堿回收率測(cè)定結(jié)果

樣品含量測(cè)定結(jié)果取5批樣品，依“”項(xiàng)制備樣品溶液，每批制備2份，分別精密吸取供試品溶液15μl，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算5批樣品的含量。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3樣品中苦參堿的含量測(cè)定結(jié)果

3討論

對(duì)制劑指標(biāo)性成分的選擇苦參、蜂膠為該制劑中的兩味主藥，而蜂膠的成分復(fù)雜，除含樹(shù)脂50%～60%，蜂蠟30%外，還含300多種的黃酮類化全物［3］，因此樣品的提純步驟復(fù)雜，回收率較低，給定量分析造成了一定困難。故針對(duì)制劑所治病癥，本實(shí)驗(yàn)選擇了具有抗菌、抗病毒、抗過(guò)敏等［4］作用的苦參堿為制劑檢測(cè)的主要指標(biāo)性成分。

對(duì)苦參堿含量測(cè)定方法的選擇目前對(duì)苦參堿含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法等［5，6］，其中2005版《中國(guó)藥典》里對(duì)苦參的含量測(cè)定主要是以氨基鍵合硅膠為填充柱來(lái)分析喹喏里西啶類生物堿，此法雖然分離效果較好，但實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣，樣品須經(jīng)固相萃取凈化；另外薄層掃描法是一種離線技術(shù)，其各步操作基本上是在開(kāi)放體系中進(jìn)行，因此，影響定量結(jié)果的因素較復(fù)雜，準(zhǔn)確較差［7］，因此為了有效控制制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合現(xiàn)有的試驗(yàn)條件，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RP-HPLC法來(lái)測(cè)定樣品中苦參堿的含量。

苦參堿選擇波長(zhǎng)的確定2005版《中國(guó)藥典》中，HPLC法測(cè)定苦參堿和氧化苦參堿的檢測(cè)波長(zhǎng)在220nm處［8］，但本實(shí)驗(yàn)取苦參堿的對(duì)照品溶液，于200～500nm波長(zhǎng)內(nèi)掃描，結(jié)果苦參堿乙醇液在210nm有最大吸收，流動(dòng)相中無(wú)水乙醇的紫外線吸收干擾小，基線穩(wěn)定，因此選擇210nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

提取方法的考察樣品的預(yù)處理比較酸提堿沉和濃氨水堿化氯仿提取的方法，結(jié)果前者操作繁瑣，提取效果不如后者。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)在制備供試液時(shí)，為了能使中藥的有效成分與多種乳膏基質(zhì)很好分離，最好采用甲醇回流使乳膏破乳，待濾液充分冷卻后再過(guò)濾的方法，這樣就能較好的去除乳劑基質(zhì)對(duì)含測(cè)成分的干擾。

流動(dòng)相的選擇本文流動(dòng)相的選擇主要是在原清益康酊劑含量測(cè)定方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步修改完善而成，因原方法主要采用薄層-高效液相色譜［9］，經(jīng)過(guò)對(duì)幾個(gè)流動(dòng)相分離樣品效果的比較，結(jié)果還是以本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相取得的效果較滿意，因?yàn)橐译娴淖贤饽┒宋蛰^小，而苦參堿也為紫外末端吸收，故采用乙腈作為流動(dòng)相的系統(tǒng)組成；而與純水流動(dòng)相相比，采用磷酸鹽-SDS離子對(duì)的流動(dòng)相，不僅可以使樣品在非極性固定相中的溶解度增大，分配系數(shù)增加，有效避免其他生物堿成分的干擾，而且能使分離成分的色譜峰形狀發(fā)生變化，保留時(shí)間延長(zhǎng)。

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