木糖渣的有機(jī)溶劑預(yù)處理及酶解性能

木糖渣的有機(jī)溶劑預(yù)處理及酶解性能岳軍;姚蘭;趙建;李雪芝;曲音波期刊名稱(chēng)】《《化工學(xué)報(bào)》》年(卷),期】2011(062)011【總頁(yè)數(shù)】7頁(yè)(P3256-3262)【關(guān)鍵詞】木糖渣;預(yù)處理;有機(jī)溶劑;木素;纖維素酶解【作者】岳軍;姚蘭;趙建;李雪芝;曲音波【作者單位】山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東濟(jì)南250100【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】S216.2目前世界經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展仍嚴(yán)重依賴(lài)化石能源，隨著對(duì)化石能源如煤炭、石油等的過(guò)度開(kāi)發(fā)，致使資源日趨枯竭，同時(shí)大量排放的二氧化碳也導(dǎo)致了嚴(yán)重的溫室效應(yīng)尋找并開(kāi)發(fā)新型的可替代能源和資源，減少人類(lèi)社會(huì)對(duì)傳統(tǒng)化石能源的依賴(lài)，已成為國(guó)際上的共識(shí)。其中資源豐富、來(lái)源廣泛并且可再生的生物質(zhì)材料被認(rèn)為將在緩解上述能源和資源危機(jī)以及減少二氧化碳排放方面發(fā)揮重要的作用［1－2］。利用木質(zhì)纖維素原料，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)出人類(lèi)需要的能源(如燃料乙醇等)和各種化工產(chǎn)品已成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)，并日益受到多個(gè)國(guó)家和政府的重視。在木質(zhì)纖維素材料的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，利用纖維素酶將纖維素降解成可發(fā)酵糖是重要的一個(gè)步驟，但由于天然木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)和組分復(fù)雜，直接進(jìn)行酶解轉(zhuǎn)化纖維素的轉(zhuǎn)化率很低，普遍認(rèn)為對(duì)木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理是提高酶解效率的必要步驟［3－4］。已報(bào)道的預(yù)處理方法有物理、化學(xué)、物理化學(xué)和生物等多種方法，或上述方法的組合。在眾多已研究的預(yù)處理方法中，采用有機(jī)溶劑乙醇對(duì)木質(zhì)纖維素材料進(jìn)行預(yù)處理是其中重要的一種。由于有機(jī)溶劑乙醇處理能部分脫除木質(zhì)纖維素材料中的木素，從而部分消除木素組分對(duì)纖維素酶的抑制和無(wú)效吸附，因此可以改善纖維素材料的酶解效率，獲得高的纖維素轉(zhuǎn)化率［5］。此外，該方法的優(yōu)點(diǎn)還在于預(yù)處理后有機(jī)溶劑可以回收并重復(fù)使用，同時(shí)有機(jī)溶劑乙醇溶出的木素與堿法預(yù)處理時(shí)溶出的堿木素相比，木素變性少、分子量較均一且木素中的活性基團(tuán)多，容易被進(jìn)一步改性加工成其他高附加值產(chǎn)品。此外，有機(jī)溶劑乙醇預(yù)處理過(guò)程中半纖維素的降解產(chǎn)物糠醛、乙酸等也可以分離出來(lái)作為產(chǎn)品出售。目前，有機(jī)溶劑處理已被用于木質(zhì)纖維素材料的分餾、工業(yè)化紙漿生產(chǎn)等。采用該方法可望實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素材料中纖維素、半纖維素和木素等組分之間的有效分離，從而真正實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素材料的生物煉制［6］。利用稀酸處理玉米芯生產(chǎn)木糖類(lèi)產(chǎn)品是目前國(guó)內(nèi)大多數(shù)相關(guān)企業(yè)普遍采用的工藝，在提取木糖后剩余的大量固體殘?jiān)咎窃┮话阕鳛槿剂戏贌峁┎糠稚a(chǎn)過(guò)程需要的熱能。由于剩余的木糖渣中含有豐富的纖維素組分，且經(jīng)過(guò)稀酸預(yù)處理后原料的結(jié)構(gòu)被破壞，更有利于纖維素酶的作用，因而可用來(lái)作為原料生產(chǎn)多種化工產(chǎn)品，但前提是首先將其中的纖維素組分高效轉(zhuǎn)化成可發(fā)酵糖（葡萄糖）。由于木糖渣的化學(xué)組成中除纖維素之外，木素的含量也很高，大量木素組分的存在限制了木糖渣纖維素的有效酶解，導(dǎo)致纖維素轉(zhuǎn)化成糖的效率低下，纖維素酶的用量增加。本文采用有機(jī)溶劑乙醇預(yù)處理木糖渣，研究了預(yù)處理工藝參數(shù)對(duì)木糖渣的化學(xué)組成和纖維素可酶解性能的影響，并與玉米秸稈和玉米芯的預(yù)處理效果進(jìn)行了比較，評(píng)價(jià)了該預(yù)處理方式的效果和應(yīng)用的可行性。實(shí)驗(yàn)材料木糖渣：山東龍力生物科技股份有限公司提供。經(jīng)分析，其化學(xué)組成為：纖維素62.50%，半纖維素1.63%，木素22.06%，苯醇抽出物9.14%，灰分7.10%。實(shí)驗(yàn)前篩分出粒徑0.42-0.83mm之間的部分，存儲(chǔ)于塑料袋中備用。玉米秸稈和玉米芯：均來(lái)自山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)。使用前用粉碎機(jī)粉碎，并取粒徑0.42-0.83mm之間的部分，進(jìn)行有機(jī)溶劑預(yù)處理實(shí)驗(yàn)。經(jīng)分析，玉米秸稈的化學(xué)組成為：綜纖維素60.49%，纖維素36.44%，木素13.69%，苯醇抽出物15.38%，灰分6.56%；玉米芯的化學(xué)組成為：綜纖維素75.26%，纖維素38.83%，木素13.51%，苯醇抽出物2.19%，灰分3.18%。纖維素酶：購(gòu)買(mǎi)自甘肅白銀賽諾生物科技有限公司。使用前取部分樣品溶解后按照文獻(xiàn)［7-8］的方法測(cè)定其濾紙酶活與阡葡萄糖苷酶活并進(jìn)行換算。該固體纖維素酶的濾紙酶活為115FPU?g-1,p-葡萄糖苷酶活力為36IU?g-1。其他分析用藥品如苯、丙酮、硫酸等均為分析純。實(shí)驗(yàn)方法1.2.1有機(jī)溶劑預(yù)處理在高壓反應(yīng)釜（型號(hào)：WDF，河南鞏義予華儀器有限公司）中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前按要求配制一定濃度的乙醇-水處理液，將50g原料（絕干重）與一定體積的乙醇溶液混合均勻后，置于反應(yīng)釜內(nèi)。通過(guò)設(shè)定加熱程序，在大約40min內(nèi)升溫至預(yù)定溫度，然后保溫到規(guī)定的時(shí)間。處理完畢后，冷卻放料，固體殘?jiān)?jīng)過(guò)過(guò)濾和洗滌后，貯于密封袋備用。預(yù)處理后物料的纖維素酶水解纖維素酶水解實(shí)驗(yàn)在三角瓶中進(jìn)行，酶解條件為：底物濃度2%，纖維素酶用量為25FPU?（g絕干底物）-1,pH4.8（0.05mol?L-1HAc-NaAc緩沖液），水解液中添加1g?L-1疊氮化鈉，在溫度50工、轉(zhuǎn)速150「min-1搖床內(nèi)進(jìn)行酶水解。水解過(guò)程中每隔一段時(shí)間取微量樣品，離心后取上清液測(cè)定葡萄糖含量，并依據(jù)式（1）計(jì)算纖維素的轉(zhuǎn)化率。1.3分析和測(cè)定方法物料中水分、纖維素、木素、苯醇抽出物、灰分含量均按照文獻(xiàn)［9］中方法進(jìn)行測(cè)定。并按照式（2）計(jì)算木素的脫除率。2.1有機(jī)溶劑預(yù)處理對(duì)木糖渣的化學(xué)組成和纖維素酶解性能的影響影響有機(jī)溶劑預(yù)處理的主要因素有：預(yù)處理溫度、預(yù)處理時(shí)間、有機(jī)溶劑的濃度、固液比等。在本文中，分別對(duì)上述工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。2.1.1預(yù)處理溫度的影響不同預(yù)處理溫度對(duì)木糖渣的化學(xué)組成和纖維素酶解性能的影響分別見(jiàn)表1和圖1。由表1可知，有機(jī)溶劑乙醇預(yù)處理后，木糖渣中的纖維素含量增加，木素含量降低。且纖維素含量和木素脫除率隨著預(yù)處理溫度的升高而增加。由圖1可看出，預(yù)處理后木糖渣中纖維素的酶解性能改善，纖維素酶解轉(zhuǎn)化率提高，且隨著預(yù)處理溫度提高，纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率不斷增加。例如，當(dāng)預(yù)處理溫度從180工增加到210工時(shí)，纖維素酶解轉(zhuǎn)化率從63.8%增加到了84.4%。有機(jī)溶劑乙醇預(yù)處理能改善木糖渣纖維素酶解性能的原因可能是：一方面，預(yù)處理可以部分地脫除木糖渣中的木素組分，因此削弱了木素對(duì)纖維素酶造成的無(wú)效吸附或致失活作用，促進(jìn)了纖維素酶對(duì)纖維素的降解作用；另一方面，高溫下的有機(jī)溶劑預(yù)處理還可能使纖維素的聚合度降低，從而有利于纖維素的進(jìn)一步降解；此外，由于木素脫除而導(dǎo)致纖維素的比表面積以及纖維素可及度的增加，也更有利于纖維素酶與纖維素接觸并發(fā)生作用，提高纖維素的酶解效率。由圖1還可看出，當(dāng)預(yù)處理溫度低于200工時(shí)，雖然與原料相比，預(yù)處理后木糖渣中的木素含量已經(jīng)有了明顯的下降，已有超過(guò)1／3的木素被脫除掉（表1），但預(yù)處理后木糖渣的纖維素轉(zhuǎn)化率并無(wú)明顯的提高。但當(dāng)預(yù)處理溫度提高到200工以上時(shí)，預(yù)處理后木糖渣的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率有較為明顯的改善。這一方面說(shuō)明木素含量對(duì)纖維素酶解的影響可能有一臨界點(diǎn)，另一方面也可能是由于高溫條件下的預(yù)處理對(duì)纖維素本身的性質(zhì)影響更大所引起的。因此，在木糖渣預(yù)處理時(shí)需要選擇高的預(yù)處理溫度才能獲得好的效果。在本文中，當(dāng)預(yù)處理溫度為210工時(shí)，處理后木糖渣纖維素72h的酶解轉(zhuǎn)化率達(dá)到84.4%。2.1.2預(yù)處理時(shí)間的影響固定預(yù)處理溫度為200工、固液比1:8、預(yù)處理液中乙醇濃度為50%，在此條件下，研究了預(yù)處理時(shí)間對(duì)木糖渣中化學(xué)組成和纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的影響，分別見(jiàn)表2和圖2。由表2和圖2可知，延長(zhǎng)預(yù)處理時(shí)間有利于木糖渣中木素的脫除和纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的提高，即有利于改善木糖渣中纖維素的酶解性能。例如，預(yù)處理時(shí)間為120min時(shí)，預(yù)處理后木糖渣纖維素的72h酶解轉(zhuǎn)化率從預(yù)處理前的69.8%提高到了80.9%。但當(dāng)預(yù)處理時(shí)間低于90min時(shí)，預(yù)處理后木糖渣纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率變化不大，雖然在預(yù)處理時(shí)間90min時(shí)，木糖渣中木素的脫除率已經(jīng)達(dá)到48.32%（表2）。這進(jìn)一步說(shuō)明，雖然資料普遍認(rèn)為物料中木素含量對(duì)纖維素的酶解影響較大，但并不是唯一的因素。2.1.3有機(jī)溶劑濃度的影響固定預(yù)處理溫度為200工、固液比1:8、預(yù)處理時(shí)間60min，在此條件下，研究了預(yù)處理時(shí)乙醇濃度對(duì)木糖渣化學(xué)組成和纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的影響，分別見(jiàn)表3和圖3。由表3和圖3可以得出，增加預(yù)處理液中的乙醇濃度，相同條件下可以增加對(duì)木糖渣中木素的脫除，降低預(yù)處理后物料中的木素含量，并在一定程度上改善纖維素的酶解性能，提高纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率。例如，當(dāng)預(yù)處理液中的有機(jī)溶劑濃度由40%增加到70%時(shí)，木糖渣的木素脫除率從10.56%提高到53.44%,72h時(shí)的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率從72.8%增加到了78.7%。但與乙醇濃度為60%時(shí)相比，雖然在乙醇濃度為70%時(shí)木素的脫除率增加了8.74%，但纖維素的酶解性能卻并沒(méi)有得到較為明顯的改善，72h時(shí)的纖維素酶解轉(zhuǎn)化率僅提高1.3%（從77.4%增加到78.7%）。再一次說(shuō)明預(yù)處理過(guò)程中的脫除木素作用并不是提高木糖渣纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的唯一因素，而需要綜合考慮預(yù)處理過(guò)程對(duì)整個(gè)物料性質(zhì)的影響。2.1.4固液比的影響固定預(yù)處理溫度為200工、預(yù)處理時(shí)間60min，乙醇濃度為50%。在此條件下，研究了固液比對(duì)木糖渣中化學(xué)組成和纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的影響，分別見(jiàn)表4和圖4。由于在乙醇預(yù)處理過(guò)程中，木素主要是被溶劑物理性地溶出，因此在一定的原料用量下，加大固液比，即增加預(yù)處理液的體積，將有利于木素的溶出，從而相對(duì)地增加預(yù)處理后木糖渣中的纖維素含量。例如：當(dāng)固液比從1:6增加到1:8時(shí)，木素脫除率從25.20%提高到41.57%，預(yù)處理后木糖渣中纖維素含量也從66.46%增加到71.34%（表4）。但從圖4可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，固液比對(duì)纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的影響并不顯著。即使將預(yù)處理時(shí)的固液比從1:6增加到1:15,72h時(shí)纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率僅從71.1%提高到76.1%。表明預(yù)處理時(shí)過(guò)大的固液比是不必要的，而且在較低的固液比下進(jìn)行預(yù)處理，還可以減少升溫過(guò)程對(duì)熱能的消耗。此外，綜合分析上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在相對(duì)較低的固液比和較高的溫度下對(duì)木糖渣進(jìn)行有機(jī)溶劑乙醇預(yù)處理，可能是獲得較高纖維素酶解轉(zhuǎn)化率的較好途徑。玉米秸稈和玉米芯的乙醇預(yù)處理效果本文同時(shí)研究了乙醇預(yù)處理對(duì)玉米秸稈和玉米芯的化學(xué)組成和纖維素酶解性能的影響。研究中，選取固液比為1:15,乙醇濃度為50%，分別在180°C和200工下處理原料60min。預(yù)處理的效果分別見(jiàn)表5和圖5。由表5和圖5可知,乙醇預(yù)處理在脫除玉米秸稈和玉米芯中的木素、提高纖維素酶解轉(zhuǎn)化率方面具有非常顯著的效果。例如，在200C下對(duì)上述兩種原料進(jìn)行乙醇預(yù)處理,玉米秸稈和玉米芯中的木素含量分別從13.69%和13.51%下降到4.89%和2.22%,木素脫除率分別達(dá)到64.28%和83.57%。預(yù)處理后玉米秸稈的纖維素在72h時(shí)的酶解轉(zhuǎn)化率從36.7%提高到80.2%，玉米芯的纖維素在72h時(shí)的酶解轉(zhuǎn)化率從35.4%提高到96.3%。此外,文獻(xiàn)［10］報(bào)道了乙醇預(yù)處理對(duì)雜交楊木酶解性能的影響，表明在180工下雜交楊木木片經(jīng)過(guò)乙醇預(yù)處理后，纖維素酶解轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到97%。說(shuō)明乙醇預(yù)處理是一種可有效改善植物纖維原料中纖維素酶解性能的預(yù)處理方式。此外，與本文中木糖渣乙醇預(yù)處理的效果相比，在同樣預(yù)處理?xiàng)l件下（如乙醇濃度50%、固液比1:15、200°C下處理60min）,無(wú)論是在木素的脫除方面（表4、表5），還是在提高纖維素酶解轉(zhuǎn)化效率方面（圖4、圖5），乙醇預(yù)處理對(duì)玉米秸稈和玉米芯的處理改善效果都更為明顯。造成這種差異的原因可能是：①玉米秸稈和玉米芯中含有大量的半纖維素組分，在乙醇預(yù)處理過(guò)程中，由于半纖維素的降解，半纖維素上大量的乙?；人嵝曰鶊F(tuán)［11］被游離出來(lái)，形成乙酸等酸性物質(zhì)，而這些形成的酸對(duì)乙醇預(yù)處理具有促進(jìn)作用，從而大大增強(qiáng)了預(yù)處理的效果，但木糖渣由于在前期稀酸處理中半纖維素幾乎已被全部抽提出來(lái)，因此在乙醇預(yù)處理過(guò)程中難以生成具有促進(jìn)作用的酸性物質(zhì)；②木糖渣在前期的稀酸處理過(guò)程中，木素的性質(zhì)會(huì)發(fā)生變化（如發(fā)生聚合作用等），而高分子量的聚合木素更難以被有機(jī)溶劑溶出；③木素性質(zhì)如活性基團(tuán)的數(shù)量和種類(lèi)等的變化，也會(huì)影響木素對(duì)纖維素酶的作用，從而影響最終的酶解效率［12－16］。有機(jī)溶劑乙醇預(yù)處理能夠脫除木糖渣、玉米秸稈和玉米芯等植物纖維原料中的木素，增加物料中的纖維素含量，提高纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率。例如，在預(yù)處理溫度210°C、預(yù)處理時(shí)間60min、固液比1:8、乙醇濃度50%（體積）條件下乙醇預(yù)處理木糖渣，72h的酶解轉(zhuǎn)化率可達(dá)到84.42%，在預(yù)處理溫度200C、預(yù)處理時(shí)間60min、固液比1:15、乙醇濃度50%（體積）條件下乙醇預(yù)處理玉米秸稈和玉米芯，72h的酶解轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了80.24%和96.26%。相對(duì)而言，該方法更適合用于預(yù)處理玉米秸稈和玉米芯這類(lèi)天然植物纖維原料，而對(duì)玉米芯經(jīng)過(guò)稀酸處理后的剩余物木糖渣的預(yù)處理效果相對(duì)較差，其主要原因可能在于物料化學(xué)組成和性質(zhì)的差異。對(duì)于木糖渣而言，選擇相對(duì)較低的固液比和較高的預(yù)處理溫度可能是一個(gè)比較理想的預(yù)處理方式。207－211作為第13屆中國(guó)科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)年會(huì)第一分會(huì)的“綠色化學(xué)科學(xué)與工程國(guó)際高端研討會(huì)”于2011年9月21日至23日在天津隆重召開(kāi)。天津市副市長(zhǎng)張俊芳，中國(guó)化工學(xué)會(huì)理事長(zhǎng)、中國(guó)工程院院士曹湘洪出席會(huì)議并在開(kāi)幕式上致辭。本次會(huì)議由中國(guó)科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)、天津市政府、中國(guó)工程院和國(guó)家外國(guó)專(zhuān)家局聯(lián)合主辦。會(huì)議特別邀請(qǐng)了三位諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者：美國(guó)加州大學(xué)圣巴巴拉分校的AlanJ.Heeger教授、美國(guó)斯科利普研究所的K.BarrySharpless教授和德國(guó)馬普學(xué)會(huì)生物物理學(xué)研究所的HarmutMicheI教授。數(shù)十位來(lái)自美國(guó)、德國(guó)、日本、加拿大、中國(guó)等國(guó)家科學(xué)院、工程院的院士以及相關(guān)領(lǐng)域著名專(zhuān)家學(xué)者參加了會(huì)議。與會(huì)專(zhuān)家學(xué)者圍繞綠色化學(xué)科學(xué)與工程國(guó)際發(fā)展動(dòng)態(tài)與展望——前沿理論、技術(shù)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用等專(zhuān)題進(jìn)行研討和交流。本次會(huì)議還舉辦了優(yōu)秀論文征集和評(píng)選活動(dòng)，共有79篇論文參與評(píng)選，經(jīng)中國(guó)工程院院士等專(zhuān)家精心遴選，其中30篇獲得了中國(guó)工程院“梅特勒－托利多杯”優(yōu)秀論文獎(jiǎng)。梅特勒－托利多大中華區(qū)總裁林桂興先生出席會(huì)議，并為優(yōu)秀論文獲獎(jiǎng)?wù)哳C獎(jiǎng)?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】LyndLR，vanZylWH，McBrideJE，LaserM.Consolidatedbioprocessingofcellulosicbiomass：anupdate[J].Curr.Opin.Biotech.，2005，16（5）：577－583JorgensenH，Vibe－PedersenJ，LarsenJ，F(xiàn)elbyC.Liquefactionoflignocelluloseathigh－solidsconcentrations[J].Biotechnol.Bioeng.，2007，96（5）：862－870[3]S合nchezoJ,CardonaCA.Trendsinbiotechnologicalproductionoffuelethanolfromdifferentfeedstocks[J].BioresourseTechnol.，2008，99（13）：5270－5295KadamKL，RydholmEC，McMillanJD.Developmentandvalidationofakineticmodelforenzymaticsaccharificationoflignocellulosicbiomass[J].Biotechnol.Progr.，2004，20（3）：698－705ArwaKurabi，AlexBerlin，NeilGilkes，DouglasKilburn，RenataBura.Enzymatichydrolysisofsteam－explodedandethanolorganosolv－pretreateddouglas－firbynovelandcommercialfungalcellulases[J].Appl.Biochem.Biotechnol.，2005，121（1－3）：219－230PanXuejun，ClaudioArato，NeilGilkes，DavidGregg，WarrenMabee，KendallPye，XiaoZhizhuang，ZhangXiao，JohnSaddler.Biorefiningofsoftwoodsusingethanolorganosolvpulping：preliminaryevaluationofprocessstreamsformanufactureoffuel－gradeethanolandco－products[J].Biotechnol.Bioeng.，2005，90（4）：473－481GhoseT.Measurementofcellulaseactivities[J].Pure＆Appl.Chem.，1987，59（2）：257－268ChahalD.Solid－statefermentationwithTrichodermareeseiforcellulaseproduction[J].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