攻讀碩士學位開題報告培訓課件

研究生：楊波指導老師：傅少志博士導師：吳敬波教授專業(yè)：腫瘤學2014年11月研究課題：葉酸受體靶向的TPT納米藥物聯(lián)合時辰放療對鼻咽癌的協(xié)同作用及相關(guān)機制研究目錄一、研究背景及現(xiàn)狀二、研究目的三、研究方法四、擬解決關(guān)鍵問題六、參考文獻五、計劃進度1、癌癥高發(fā)2、鼻咽癌在我國南方及東南亞國家多發(fā)一、研究背景、基礎及現(xiàn)狀《一》研究背景1、生物節(jié)律紊亂：作為一種基本的生命現(xiàn)象，生物節(jié)律的紊亂與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[1]《二》研究基礎[1]SawidisC,KoutsilierisM.Circadianrhythmdisruptionincancerbiology.Mol.Med.2012:1249-602、細胞周期：移植于裸鼠的人鼻咽癌細胞(CNE-Ⅱ)中DNA合成具生物節(jié)律,G1、S、G2、M期細胞分別隨時間變化也有顯著差異[2,3][2]XianLJ,SunJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisinnasopharyngealcarcinomacell.Chronobiol.Int.2002,19(1):69.[3]SunJ,XianLJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisandapoptosiscorrelatedgeneexpressioninbonemarrowcellsofnudebearinghumannasopharyngealcarcinoma.AiZheng,2002,21(8):833放射敏感性與細胞增殖周期具有時相關(guān)系：細胞在接近和處于M期時最敏感，S后期對放射最抗拒多種腫瘤細胞進入S期的比例與正常細胞通常有8-12小時的間隔優(yōu)化調(diào)整對腫瘤細胞進行放療的時間[4,5]為腫瘤放療選擇更合適的時間避開正常細胞的合成高峰最大限度殺滅腫瘤細胞[4]UlmerW,CornelissenG,RevillaM,etal.Circadianandcircaseptandependenceofthebeta-ATPpeakoffourdifferentcancercellcultures:implicationsforchronoradiotherapyScriptaMdeica,2001,74(2):87.[5]BjarnasonGA,MackenzieRG,NabidA,etal.Comparisonoftoxicityassociatedwithearlymorningversuslateafternoonradiotherapyinpatientswithhead-and-neckcancer:AprospectiverandomizedtrialofthenationalcancerinstituteofCanadaClinicalTrialsGroup(HN3).Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.2009;73:166-72.時辰治療人體正常組織腫瘤組織藥代謝動力學腫瘤時辰治療學[6]生物鐘理論3、腫瘤時辰治療學[6]InnominatoPF,LeviFA,BjarnasonGA.Chronotherapyandthemolecularclock:clinicalimplicationsinoncology.Adv.DrugDeliveryRev.2010;62:979-1001時辰治療:旨在制定優(yōu)化的時間調(diào)節(jié)方案,選擇毒性最小、療效最好的時間給予治療不同時辰放療節(jié)律標志細胞增殖周期體溫腫瘤細胞代謝指標對鼻咽癌的時辰化療研究也發(fā)現(xiàn)，時辰給藥較常規(guī)給藥療效更佳，副反應也顯著減輕[7,8][7]ZarogoulidisP,DarwicheK,HuangH,etal.Timerecall;Futureconceptofchronomodulatingchemotherapyforcancer.Curr.Pharma.Biotechnol.2013;14:632-42.[8]LinHX,HuaYJ,ChenQY,etal.Randomizedstudyofsinusoidalchronomodulatedversusflatintermittentinductionchemotherapywithcisplatinand5-fluotouracilfollowedbytraditionradiotherapyforlocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma.Chin.J.Cancer.2013;32(9):502-11《三》研究現(xiàn)狀前期實驗證明TPT對人鼻咽癌裸鼠移植瘤有放射增敏作用[9-11]其重要原因可能為：①細胞周期變化②促進凋亡③拓撲異構(gòu)酶-I的表達水平改變拓撲替康的時辰放射曾敏作用機制：①腫瘤的乏氧程度②細胞周期③DNA損傷④拓撲異構(gòu)酶-I的表達水平[12][12]ZhangY,ChenX,RenP,etal.Synergisticeffectofcombinationtopotecanandchronomodulatedradiationtherapyonxenograftedhumannasopharyngealcarcinoma.InRadiat.Oncol.Biol.Phys.2013,87(2):356-62無關(guān)圖片TPT傳統(tǒng)劑型缺乏靶向性鼻咽癌解剖位置的特殊性納米醫(yī)學控制藥物釋放速率延長藥物在血液中的半衰期具有靶向性[13][13]LiuJ,HuangY,KumarA,etal.pH-Sensitivenano-systemsfordrugdeliveryincancertherapy.Biotechnol.Adv.2013,Inpress.[14]Hernandez-PedroNY,Rangel-LopezE,Magana-MaldonadoR,etal.ApplicationofNanoparticlesonDiagnosisandTherapyinGliomas.BioMed.Res.Inter.2013,Hindawi.當前的納米藥物主要依靠自身的被動靶向功能（EPR效應）在腫瘤組織富集，并不具備對腫瘤細胞產(chǎn)生特異性識別的主動靶向功能[14-16]不理想！無關(guān)圖片《四》研究新進展鼻咽癌細胞表面有豐富的葉酸受體表達[17]新思路：構(gòu)建葉酸受體靶向的納米藥物傳輸體系[17]XieM,ZhangH,XuY,etal.Expressionoffolatereceptorsinnasopharyngealandlaryngealcarcinomaandfolatereceptor-mediatedendocytosisbymoleculartargetednanomedicine.Int.J.Nanomed.2013;8:2443-51.載藥粒子示意圖MPEGTPTFAPCL載藥粒子載有藥物的納米粒子進入腫瘤細胞載體降解，藥物釋放殺死腫瘤細胞[18][18]WeiX,PhilipSL.Folate-targetedtherapiesforcancer.J.Med.Chem.2010;53:6811-24.作用過程示意圖二、研究目的（1）研究鼻咽癌細胞對拓撲替康納米藥物的特異性攝取，驗證其主動靶向功能。（3）構(gòu)建具有主動靶向功能和放射增敏功能的納米藥物制劑（2）闡明增敏機制研以致用知其所以然技術(shù)路線圖合成MPEG-PCL聚合物合成MPEG-FA-PCL聚合物制備MPF/TPT納米粒子建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型、分組并進行時辰放療三、研究方法單純放療組主動靶向納米藥物+放療組非主動靶向納米藥物+放療組單純主動靶向納米藥物組非納米藥物組生理鹽水組腫瘤大小及動物體征觀察處死動物、剝離瘤塊、組織固定和凍存免疫組化檢測腫瘤細胞放射敏感性流式細胞技術(shù)檢測細胞周期免疫組化檢測腫瘤組織微血管密度免疫組化檢測葉酸受體表達免疫組化檢測腫瘤乏氧情況免疫組化檢測TOPI表達TUNEL檢測細胞凋亡數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計分析闡明主動靶向功能的拓撲替康納米粒子對時辰放療曾敏的分子機制聚甲氧基乙二醇（MPEG）己內(nèi)酯（CL）MPEG-PCL葉酸（FA）《一》體外實驗——1、納米藥物的制備MPEG-PCL-FATPTMPA/TPTMPF/TPT2、MPF/TPT理化性質(zhì)及相關(guān)生物學性質(zhì)研究透射電鏡（TEM）形貌動態(tài)光散射法粒徑及分布高效液相色譜（HPLC）載藥量和包封率PBS透析袋法藥物釋放行為溶血實驗血液相容性MTT細胞毒性3、驗證主動靶向性主動靶向納米藥物非主動靶向納米藥物非納米藥物生理鹽水組人鼻咽癌低分化鱗癌細胞株（CNE-II）免疫組化檢測攝取量《二》體內(nèi)實驗人鼻咽癌低分化鱗癌細胞株（CNE-II）細胞培養(yǎng)接種裸鼠裸鼠生物節(jié)律建立《三》實驗分組3HALO9HALO15HALO21HALOMPF/TPT+RT10101010MP/TPT+RT10101010MPF/TPT10101010TPT10101010RT10101010NS10101010分組時辰《四》放射計量效應曲線不同時辰采用不同放射計量對比最佳放射治療時辰點以及最佳劑量Envision二步免疫組化法腫瘤細胞放射敏感性拓撲異構(gòu)酶I的表達裸鼠腫瘤組織乏氧程度TUNEL檢測腫瘤細胞凋亡腫瘤細胞周期分析LSAB法檢測腫瘤組織微血管《五》機制探討四、擬解決的關(guān)鍵問題（1）制備TPT納米藥物傳輸體系。（2）研究納米藥物運載體是否具有主動靶向功能？（3）納米藥物與時辰放療聯(lián)合是否具有協(xié)同作用并研究其機制？五、計劃進度起止年限計劃進度和預期目標2014.11~2015.62015.6~2016.22016.2~2016.102016.10~2017.6構(gòu)建主動靶向的納米藥物并進行體外理化性質(zhì)研究納米藥物的體內(nèi)外抗腫瘤效果及主動靶向功能驗證體內(nèi)實驗，考察納米藥物的抗腫瘤效果機制研究[1]SawidisC,KoutsilierisM.Circadianrhythmdisruptionincancerbiology.Mol.Med.2012:1249-60[2]XianLJ,SunJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisinnasopharyngealcarcinomacell.Chronobiol.Int.2002,19(1):69.[3]SunJ,XianLJ,CaoQY,etal.CircadianrhythmsofDNAsynthesisandapoptosiscorrelatedgeneexpressioninbonemarrowcellsofnudebearinghumannasopharyngealcarcinoma.AiZheng,2002,21(8):833[4]UlmerW,CornelissenG,RevillaM,etal.Circadianandcircaseptandependenceofthebeta-ATPpeakoffourdifferentcancercellcultures:implicationsforchronoradiotherapyScriptaMdeica,2001,74(2):87.六、參考文獻[5]BjarnasonGA,MackenzieRG,NabidA,etal.Comparisonoftoxicityassociatedwithearlymorningversuslateafternoonradiotherapyinpatientswithhead-and-neckcancer:AprospectiverandomizedtrialofthenationalcancerinstituteofCanadaClinicalTrialsGroup(HN3).Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.2009;73:166-72.[6]InnominatoPF,LeviFA,BjarnasonGA.Chronotherapyandthemolecularclock:clinicalimplicationsinoncology.Adv.DrugDeliveryRev.2010;62:979-1001[7]ZarogoulidisP,DarwicheK,HuangH,etal.Timerecall;Futureconceptofchronomodulatingchemotherapyforcancer.Curr.Pharma.Biotechnol.2013;14:632-42.[8]LinHX,HuaYJ,ChenQY,etal.Randomizedstudyofsinusoidalchronomodulatedversusflatintermittentinductionchemotherapywithcisplatinand5-fluotouracilfollowedbytraditionradiotherapyforlocoregionallyadvancednasopharyngealcarcinoma.Chin.J.Cancer.2013;32(9):502-11.[9]吳敬波、文慶蓮、范娟等.拓撲替康對鼻咽癌放射曾敏的體內(nèi)實驗[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2007,14（2）：82-85[10]文慶蓮、吳敬波.拓撲替康對鼻咽癌放射曾敏機制的研究[J].中國癌癥雜志，2005,15（1）：49-51[11]文慶蓮、吳敬波、何芬等.拓撲替康對裸小鼠鼻咽癌放射曾敏作用的分子水平探討[J].中國腫瘤臨床，2006,23（13）：1000-8179[12]ZhangY,ChenX,RenP,etal.Synergisticeffectofcombinationtopotecanandchronomodulatedradiationtherapyonxenograftedhumannasopharyngealcarcinoma.InRadiat.Oncol.Biol.Phys.2013,87(2):356-62[13]LiuJ,HuangY,KumarA,etal.pH-Sensitivenano-systemsfordrugdeliveryincancertherapy.Biotechnol.Adv