實驗三-酶學(xué)實驗

實驗三酶學(xué)實驗實驗內(nèi)容實驗十四pH值對酶促反應(yīng)速度的影響實驗十五溫度對酶促反應(yīng)速度的影響實驗十六底物濃度對酶促反應(yīng)速度的影響實驗十七抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響實驗十四pH值對酶促反應(yīng)速度的影響【實驗?zāi)康摹?．掌握pH對酶促反應(yīng)速度的影響。2．了解測定酶活性的原理、學(xué)會操作。【實驗原理】酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，構(gòu)象及電荷狀態(tài)影響酶與底物的結(jié)合催化，因此酶活性會受溶液pH的影響。底物或輔基的解離程度受溶液pH的影響。酶的最適pH值：一定的pH范圍內(nèi)，酶才表現(xiàn)其催化活性，而且在某一pH值時，酶的催化活性達最大值。AKP（堿性磷酸酶）活性測定：磷酸苯二鈉法鐵氰化鉀【實驗試劑】（1）甘氨酸緩沖液：多種pH值（2）酶液（3）0.04mol/L基質(zhì)液（4）0.3%4-氨基安替比林（5）0.5%鐵氰化鉀溶液【實驗方法】1.取小試管6支，編號，按下表操作：管號

123456甘氨酸緩沖液pH8.0pH9.0pH10.0pH11.0pH12.01.01.01.01.01.0蒸餾水1.00.04mol/L基質(zhì)液1.01.01.01.01.01.0

置37℃水浴保溫15min酶液1.01.01.01.01.0

2．立即混勻，置于37℃水浴中，保溫15min。3．保溫結(jié)束，各管分別加0.2mol/lNaOH1ml終止反應(yīng)。4．各管分別加入1.0ml0.3%4-氨基安替比林和2.0ml0.5%鐵氰化鉀溶液，充分混勻，放置10min，肉眼觀察，比較各管顏色之深淺，用+→++++表示，觀察哪一pH值下酶活性最強。實驗十五溫度對酶促反應(yīng)速度的影響

【實驗?zāi)康摹?．掌握溫度對酶促反應(yīng)速度的影響。2．了解溫度對酶促反應(yīng)速度影響的測定方法?！緦嶒炁嘣怼繙囟忍锷咛枌γ杆纱俜雌繎?yīng)產(chǎn)占生兩艦種相狀反的尺效應(yīng)萍：反應(yīng)遭速度雄隨溫育度升賠高而推加快盯，酶蛋醫(yī)白變面性失晨活的傾速度商隨溫激度升朽高迅僅速增酬加，旬從而去使反世應(yīng)速夏度減昂慢。酶的忙最適撕溫度但：酶促者反應(yīng)濕速度倉最快旦時的哈環(huán)境渴溫度優(yōu)。實驗小檢測徐對象：堿卵性磷昆酸酶（1）0.綠1m繭ol黑/L疊p鏡H1已0碳酸貞緩沖草液（2）0.垂04師mo到l/地L基質(zhì)槍液（3）酶形液（4）0.往3%封4域-氨基朋安替迎比林（5）0.潛5%鐵氰但化鉀品溶液【實驗值試劑】【實驗曠方法】1.取小道試管5支，帥編號偵，按須下表元操作加入遵酶液幻玉后，立即岔混勻，再定置各密溫度弄下保奪溫。

管號

123450.1mol/LpH10碳酸緩沖液1.01.01.01.01.00.04mol/L基質(zhì)液1.01.01.01.01.0預(yù)溫5min冰浴室溫37℃75℃室溫血清或酶液0.10.10.10.1-保溫15min冰浴室溫37℃75℃室溫2．保習(xí)溫結(jié)稿束后元，立即加入1賄ml什0務(wù).2嚷m原ol搶/lNa益OH終止析反應(yīng)內(nèi)。3．各難管再蘭分別燙加入0.晶3%帶4偵-氨基攔安替拘比林1.敘0滾ml及0.樸5%鐵氰搏化鉀兔溶液2.雁0乞ml，充認分混同勻，窯室溫準(zhǔn)下放木置10創(chuàng)m濤in，4．肉制眼觀語察，甲比較乓各管掠顏色搭之深禁淺，政用+就→掉++贈++表示秤，觀紹察哪吸一溫舅度下弄酶活交性最關(guān)強。底物津濃度蓄對酶穴促反么應(yīng)速膝度的熔影響【實驗邀目的】掌握沖有關(guān)值酶促源反應(yīng)蜘動力沈?qū)W的醬基本磁知識鐵。【實驗譽原理】在溫標(biāo)度、pH及酶鑰濃度肺恒定役的條墻件下罷，底具物濃直度對燒酶的擔(dān)催化瓜作用巖有很做大的仙影響困。在腰一般匙情況物下，仍當(dāng)?shù)准娢餄鉄挾群鼙鹊蜁r碗，酶角促反勺應(yīng)的笨速度房誠（V）隨錦底物瓜濃度〔S汽〕的增昨加而毒迅速抱加快常，但眼當(dāng)?shù)讋?wù)物濃覆度繼展續(xù)增箱加時蜓，反沫應(yīng)速嗎度的販增加骨率就愁比較譽小，則當(dāng)?shù)茁∥餄馔於仍龉渭拥焦S某種似程度廈時，肝反應(yīng)螺速度蘆達到睜一個撐極限鴿值（勾最大涼速度Vm）VmaxV[S]KmVmax/2ＶVmax[S]Km+[S]＝──【實驗啟內(nèi)容雜與方碧法】1.取試退管6支，豆編號弓，按克表操縫作試劑（ml）1234560.04mol/L基質(zhì)液0.10.20.30.40.8—0.1mol/LpH10碳酸緩沖液0.70.70.70.70.70.7蒸餾水1.11.00.90.80.41.237℃水浴保溫5min

酶液0.10.10.10.10.10.12.加酶耕液后圓，各管炭立即臟混勻，記絨錄時雨間，評各管膨在37垂℃水浴慶中保浪溫15義mi滿n，保翠溫結(jié)漠束，立即近加入0.爹2m濱ol悲/LNa賞OH1.理0m紗L以終圖止反立應(yīng)。3．各閘管中還分別陳加入0.荷3%亭4栗-氨基騎安替硬比林1.譜0m羽L，0.典5%鐵氰徒化鉀2.天0m特L，充分蜘混勻，放清置10嘆mi引n，以成空白謹(jǐn)管為書對照陷，于51膝0n毒m波長骨處比淡色。抑制欠劑對導(dǎo)酶促肅反應(yīng)針?biāo)俣瘸蟮挠昂憽緦嶒炥r(nóng)目的】掌握陪抑制還劑對薄酶的盤活性光的影包響及掏檢測聲方法串?！緦嶒炑怼糠材軅€降低噴酶的秋活性之，甚斃至使攝酶完涉全喪困失活雄性的徒物質(zhì)塔，稱沒為酶堤的抑父制劑勇。競爭查性抑轎制劑拳的作碧用特太點是衰使酶韻的Km值增素大，半但不傭影響立酶促莫反應(yīng)扮的最厘大速緞度Vm。非競蠅爭性佩抑制晴劑的瀉作用錦特點派是酶惠的Km值不雙變，胳但酶爛促反兇應(yīng)的德最大幼速度Vm降低約?！緦嶒炈貎?nèi)容渾與方丸法】1．取帳試管6支，欄編號長，按杯表2-金12操作試劑（ml）1234560.04mol/L基質(zhì)液0.10.20.30.40.8—0.04mol/L磷酸氫二鈉0.10.10.10.10.10.10.1mol/LpH10碳酸緩沖液0.70.70.70.70.70.7蒸餾水1.11.00.90.80.41.237℃水浴保溫5min

酶液0.10.10.10.10.10.12．加斥酶液閱后各瓦管立即所混勻，記謎錄時昌間，臣在37菠℃水浴唯中保梳溫15性mi客n后，立即鈔加入0.態(tài)2m霜ol莊/LNa涂OH1.階0m棒L以終薄止反攤應(yīng)。3．各服管中秒分別足加入0.撲3%麗4嶄-氨基膽安替犯比林1.衛(wèi)0m臥L，0.洗5%鐵氰帽化鉀論溶液2.容0m估L，充分窄混勻，室蟲溫放精置10檢mi換n。以鎖空白濟管為歪對照解，于51羅0n勢m波長身處比育色。【注意炮問題】底物刪溶液書中不架應(yīng)有承游離察