男科學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展

關(guān)于男科學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)展第1頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

精液分析是評(píng)價(jià)男性生育能力的最基本檢驗(yàn)手段。理論上，精液分析是一個(gè)很簡(jiǎn)單的操作過(guò)程，只要將一滴精液置于玻片上，進(jìn)而確定其相關(guān)參數(shù)即可。然而，實(shí)際上，精液分析所得的每一個(gè)參數(shù)都需要大量的專(zhuān)業(yè)知識(shí)、細(xì)致認(rèn)真的操作及必要的質(zhì)量控制措施。第2頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

Keel等報(bào)告了美國(guó)紐約、哥倫比亞、洛山磯、明尼蘇達(dá)幾百家男科實(shí)驗(yàn)室對(duì)精子密度、形態(tài)學(xué)、活率及抗精子抗體的室間質(zhì)量控制結(jié)果，精子密度的結(jié)果顯示，一份精液標(biāo)本的精子密度差異范圍達(dá)3~492×106/ml，手工檢測(cè)的變異系數(shù)（CV）為30%~138%，計(jì)算機(jī)輔助的精液分析（CASA）的CV為24%~99%。不同實(shí)驗(yàn)室精子密度的較大差異提示，精子計(jì)數(shù)方法的不同、計(jì)數(shù)池種類(lèi)的不同以及操作的標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)精子計(jì)數(shù)結(jié)果有著直接的影響。第3頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三一、精液常規(guī)檢查

1、精液檢測(cè)工具不斷更新（1）血細(xì)胞計(jì)數(shù)板沿用50余年

（2）Makler精子計(jì)數(shù)板1978年以色列Makler發(fā)明（3）Macro精子計(jì)數(shù)板（4）Microcell計(jì)數(shù)池1990年Ginabury和Armand發(fā)明一次性使用（5）2004年，美國(guó)MillenniumSciences公司Cell-VU精子記數(shù)池和Cell-VU預(yù)染色形態(tài)載波片。

第4頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三計(jì)算機(jī)輔助的精液分析

80年代發(fā)展的新技術(shù)，除可分析精子密度、活動(dòng)百分率等指標(biāo)外，在分析精子運(yùn)動(dòng)能力方面顯示了其獨(dú)特的優(yōu)越性。第5頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第6頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第7頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第8頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第9頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第10頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第11頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三第12頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三全自動(dòng)精子分析儀（以色列）MedicalElectronicSystems第13頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

用已知濃度的乳膠珠溶液對(duì)目前國(guó)際上常用的３種精子計(jì)數(shù)池進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

３種精子計(jì)數(shù)池的質(zhì)量評(píng)估第14頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料

Cell-VU計(jì)數(shù)池（MillenniumSciencesInc，NewYork，USA）Makler計(jì)數(shù)池（Sefi-MedicalInstrument，Haifa，Israel）血球計(jì)數(shù)池（上海求精生化試劑儀器有限公司）標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠溶液（HamiltonThorneBiosciences，USA）2份，濃度分別為：（35±5）×106/ml，（18±2.5）×106/ml。第15頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三1.２方法1.2.1Cell-VU計(jì)數(shù)法1.2.2Makler計(jì)數(shù)法1.2.3血球計(jì)數(shù)池法1.３統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

不同計(jì)數(shù)池的計(jì)數(shù)結(jié)果以x±s表示，樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)

第16頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三2結(jié)果ChambernConcentrationforstandardsolution1Concentrationforstandardsolution2Cell-VU3037.63±4.8918.22±1.77Hemacytometer3042.74±4.98*20.48±1.56*Makler1553.52±6.67*△24.97±4.75*△表1不同精子計(jì)數(shù)池的乳膠珠濃度與Cell-VU計(jì)數(shù)池相比，*：P<0.001；與血球計(jì)數(shù)池相比，△：P<0.001第17頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三Cell-VU計(jì)數(shù)池的濃度最接近標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠的濃度，平均變異系數(shù)（CV）分別為7.51%和1.22%，而血球計(jì)數(shù)池的CV分別為22.11%和13.78%，Makler計(jì)數(shù)池的CV分別為52.91%和38.72%。提示，Cell-VU計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)結(jié)果最準(zhǔn)確，而血球計(jì)數(shù)池和Makler計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)結(jié)果明顯偏高，尤以Makler計(jì)數(shù)池與標(biāo)準(zhǔn)乳膠珠濃度相差最大，差異達(dá)52.91%。

第18頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三室內(nèi)質(zhì)控和室間質(zhì)控是保證不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果準(zhǔn)確和可靠的重要措施之一。精子計(jì)數(shù)是男科實(shí)驗(yàn)室目前考慮較多的質(zhì)控項(xiàng)目之一，目前最大的挑戰(zhàn)來(lái)自精子計(jì)數(shù)方法學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)化和監(jiān)測(cè)。本研究顯示，Cell-VU計(jì)數(shù)池的準(zhǔn)確性和精確性均優(yōu)于血球計(jì)數(shù)池和Makler計(jì)數(shù)池，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而且，Cell-VU可一次性或反復(fù)多次使用，這在計(jì)數(shù)傳染性較強(qiáng)的樣本時(shí)將顯示出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。因此，我們建議要建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的計(jì)數(shù)池操作系統(tǒng)用于所有實(shí)驗(yàn)室，從而為不同實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)，最終提高所有實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。Cell-VU應(yīng)是此標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)池的最佳選擇。

第19頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三2.精子功能測(cè)定

（1）傳統(tǒng)經(jīng)典的“倉(cāng)鼠卵穿刺實(shí)驗(yàn)”（2）精子-宮頸粘液穿透試驗(yàn)（3）毛細(xì)管穿透試驗(yàn)（4）低滲腫脹試驗(yàn)（5）吖啶橙染色(熒光顯微鏡)

（6）精子DNA完整性檢測(cè)（流式細(xì)胞儀）

第20頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

精子DNA完整性檢測(cè)亦稱(chēng)精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，SCSA），是應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)精子功能的方法之一。精子發(fā)生過(guò)程中，魚(yú)精蛋白逐步取代組蛋白與DNA結(jié)合。精子進(jìn)入附睪后，魚(yú)精蛋白的組成不再改變。但附睪中精子在逐步成熟的過(guò)程中，魚(yú)精蛋白中大量的巰基(SH)不斷被氧化成二硫鍵(S=S)，與DNA結(jié)合更加緊密，使DNA更具抗酸能力，維持了雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。精子DNA完整性檢測(cè)（流式細(xì)胞儀）第21頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

而染色質(zhì)異常的精子，魚(yú)精蛋白中多數(shù)巰基未被氧化，在酸的作用下易變性為單鏈DNA。根據(jù)這一原理，用酸處理精液樣品，再行吖啶橙(AO)染色，AO可與雙鏈DNA結(jié)合呈單體形式發(fā)出綠色熒光，與單鏈DNA結(jié)合呈聚合物形式發(fā)出紅或黃色熒光。然后通過(guò)配有專(zhuān)用軟件的流式細(xì)胞儀可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理得出SCSA參數(shù)。精子DNA完整性檢測(cè)（流式細(xì)胞儀）第22頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三二、生精細(xì)胞檢查與睪丸活檢1、生精細(xì)胞檢查精液中除成熟的精子外，亦可見(jiàn)未成熟的生精細(xì)胞，包括精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、早期和晚期精子細(xì)胞等

生精細(xì)胞檢查方法：

染色法熒光原位雜交單克隆抗體免疫組化法流式細(xì)胞術(shù)第23頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三2、睪丸活檢

開(kāi)放活檢、細(xì)針穿刺、活檢槍、高能多譜勒超聲為基礎(chǔ)的睪丸活檢

70年代FSH可用放免方法測(cè)定，F(xiàn)SH水平可以反映生精功能受損程度，睪丸活檢范圍逐漸縮小，其適應(yīng)證僅限于睪丸體積正常、FSH水平正常或輕度增高的無(wú)精子癥病人。

80年代，精漿生化指標(biāo)的測(cè)定可排除阻塞性無(wú)精子癥，睪丸活檢范圍更小。近年來(lái)，隨著顯微外科的發(fā)展和顯微受精技術(shù)的應(yīng)用，從精液中分離一條精子即可使卵子受精達(dá)到生育目的。因此，需行睪丸活檢的病例更是寥寥無(wú)幾。第24頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三三、白細(xì)胞精子癥的檢測(cè)

精液白細(xì)胞數(shù)>1×106/ml，可診斷為白細(xì)胞精子癥白細(xì)胞可通過(guò)吞噬作用、產(chǎn)生活性氧（ROS）、分泌一些細(xì)胞因子等途徑使精子損傷。精液中粒細(xì)胞為產(chǎn)生ROS的主要細(xì)胞。

第25頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三精液中白細(xì)胞的檢測(cè)方法；1、對(duì)ROS的檢測(cè)：依賴(lài)魯米諾的化學(xué)發(fā)光分析法2、直接鏡檢法3、瑞-姬染色或巴氏染色法染色4、過(guò)氧化物酶染色法（正甲苯胺蘭、聯(lián)苯胺及鄰甲苯胺過(guò)氧化物酶染色）5、熒光原位雜交法6、免疫細(xì)胞化學(xué)法CD45，CD4，CD87、彈性蛋白酶、IL-8及溶菌酶測(cè)定

第26頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三四、免疫性不育的檢測(cè)

檢測(cè)方法很多，3種類(lèi)別的抗精子抗體均可測(cè)，檢測(cè)的抗精子抗體為總的或各種類(lèi)別的抗精子膜抗原的抗體，而精子膜與人體其他器官組織的細(xì)胞膜有許多共同抗原，因而這種抗原抗體反應(yīng)的特異性不高。如果用針對(duì)精子或睪丸特異性抗原，或針對(duì)與透明帶識(shí)別和結(jié)合有關(guān)的抗原作為包被抗原來(lái)檢測(cè)AsAb，其臨床意義就會(huì)很大。

Naz等用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)確定，受精抗原FA-1和YLP（12）具有此特性，并且它們的抗體存在于不育男性的精漿和血清中建立這種特異性診斷方法是今后取代總AsAb檢測(cè)的唯一途徑。第27頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三五、生殖道感染的檢測(cè)

大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、綠膿桿菌、淋球菌、肺炎克雷伯氏菌、結(jié)核桿菌、衣原體、支原體、單純皰疹病毒、人乳頭瘤病毒、腺相關(guān)病毒、陰道毛滴蟲(chóng)等皆可感染生殖道，而且可致不育。各種細(xì)菌感染，往往通過(guò)菌體本身及其釋放出的毒素、酶類(lèi)等影響精子質(zhì)量病毒的感染更為隱蔽臨床實(shí)驗(yàn)室多用ELISA法檢測(cè)各種病毒的抗體，通過(guò)抗體的分型可粗略判斷病毒的感染時(shí)期第28頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三衣原體和支原體感染被認(rèn)為是最常見(jiàn)的性傳播疾?。⊿TD）病原與男性不育密切相關(guān)的衣原體為沙眼衣原體（CT），其可引起急性附睪炎和慢性前列腺炎等。目前，檢測(cè)沙眼衣原體感染的方法主要有金標(biāo)法、ELISA法及培養(yǎng)法，尤以ELISA法最為常用與男性不育密切相關(guān)的支原體為解脲支原體臨床實(shí)驗(yàn)室多采用培養(yǎng)法檢測(cè)。第29頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三六、精漿生化的檢測(cè)

精漿中的一些生化標(biāo)志可反映男性附屬性腺、附睪及睪丸生精功能等，有利于綜合評(píng)價(jià)不育的發(fā)病原因和機(jī)制。例如，檸檬酸、鋅、鎂、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和酸性磷酸酶可反映前列腺功能，其中的酸性磷酸酶檢測(cè)已成為男科實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢查，常用磷酸苯二鈉法；

果糖與前列腺素可反映精囊腺功能，常用間苯二酚法檢測(cè)果糖；

游離左旋肉毒堿、甘油磷酸膽堿和α-葡糖苷酶可反映附睪功能。第30頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三精漿總α-葡糖苷酶檢測(cè)中應(yīng)注意3點(diǎn)離心速度不同，精漿總α-葡糖苷酶活性有所差異精漿總α-葡糖苷酶活性與禁欲時(shí)間的長(zhǎng)短密切相關(guān)精漿總α-葡糖苷酶活性的檢測(cè)應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量控制

第31頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三不同速度離心后的精漿中α葡糖苷酶水平第32頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三禁欲時(shí)間對(duì)精漿α葡糖苷酶的影響Abstinencetime(day)nAlpha-glucosidase(U/ml)Seminalplasma(1000gfor10min)Seminalplasma(3000gfor15min)2~31236.47±12.2434.04±11.224~51649.62±16.86*47.73±17.37*6~71451.14±19.76*46.76±17.70*>8968.70±14.10*#△63.86±13.63*#△第33頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三精漿果糖檢測(cè)中應(yīng)注意4點(diǎn)：①果糖標(biāo)準(zhǔn)液配制后應(yīng)放置2周后使用，而使用2周后出現(xiàn)吸光度降低時(shí)應(yīng)立即更換新的果糖標(biāo)準(zhǔn)液②離心速度不同精漿果糖濃度稍有差異③精液液化后應(yīng)立即離心將精子和精漿分離，否則會(huì)影響精漿果糖檢測(cè)結(jié)果④精漿果糖測(cè)定中應(yīng)引入質(zhì)量控制體系第34頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三果糖標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的監(jiān)測(cè)第35頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三精液放置時(shí)間對(duì)果糖濃度的影響GroupnFructose(mmol/L)0h4815.73±6.562h4815.07±6.56a4h4814.73±6.51b,c第36頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三精漿稀釋后放置時(shí)間對(duì)酸性磷酸酶活性的影響

隨機(jī)選取10例精漿，1∶10000稀釋后立即檢測(cè)ACP活性或稀釋后放置30min再次檢測(cè)ACP活性，兩者比較有極顯著性差異（t

＝3.770，P

＝0.001）。第37頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

抑制素B被認(rèn)為是男性精子發(fā)生的血清標(biāo)志物。成年男性血清中維持可檢測(cè)的抑制素B水平需要生精細(xì)胞的存在，唯支持細(xì)胞綜合征（SCO）男性血清抑制素B水平極低。

Brugo-Olmedo等認(rèn)為血清抑制素B在預(yù)言非阻塞性無(wú)精子癥病人的睪丸精子存在時(shí)比血清FSH更準(zhǔn)確。除此之外，抑制素B還可用于兒童隱睪、性早熟的診斷，監(jiān)測(cè)放、化療對(duì)男性生精功能的損傷等。目前，抑制素B的檢測(cè)通常使用雙抗體夾心ELISA法。第38頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三七、精漿細(xì)胞因子的檢測(cè)

精漿細(xì)胞因子由男性泌尿生殖道內(nèi)的各種細(xì)胞分泌，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、腫瘤壞死因子（TNF）、各種白細(xì)胞介素（IL）及某些可溶性受體等。目前認(rèn)為，與男性不育有關(guān)的細(xì)胞因子主要有IL-6和IL-8，不育病人精漿中IL-6和IL-8水平明顯高于生育力正常的男性。測(cè)定IL-6和IL-8的方法有：生物學(xué)方法、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法，以免疫學(xué)方法多用，尤以ELISA和RIA常用。

第39頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三

八、精子發(fā)生相關(guān)基因的檢測(cè)

與精子發(fā)生相關(guān)的基因很多，無(wú)精子病人的基因缺失均發(fā)生于Y染色體的長(zhǎng)臂,主要位于Yq11.23中，而且并非是單一基因，可能含有整個(gè)基因大家族。

1996年，Vogt等人在更大范圍對(duì)無(wú)精子、少精子病人進(jìn)行了研究，認(rèn)為在3個(gè)區(qū)域均存在AZF，分別為AZFa，AZFb，AZFc，對(duì)這些病人睪丸活檢發(fā)現(xiàn)，睪丸的病理改變與AZF的缺失部位有顯著相關(guān)性。

AZFa：Sy84,Sy86AZFb：Sy124，Sy127，Sy132,Sy134AZFc：Sy152，Sy157，Sy239，Sy242，Sy254，Sy255

第40頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三AZF檢測(cè)：SRY存在于基因組中，Yq上的AZFa,b,c區(qū)域的位點(diǎn)全部丟失↓

病人正常男性正常女性空白對(duì)照第41頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三九、遺傳學(xué)檢測(cè)

男性不育的遺傳學(xué)檢測(cè)主要是檢測(cè)精子染色體的異常。常規(guī)使用染色體顯帶技術(shù)，如G帶、Q帶等技術(shù)，然而其敏感度不及FISH技術(shù)

FISH技術(shù)可用于研究復(fù)雜染色體突變?nèi)缧匀旧w異常、未知的小標(biāo)志物、環(huán)狀染色體、嵌合體及易位等

Y染色體長(zhǎng)臂特異區(qū)的微缺失與不育相關(guān)第42頁(yè)，講稿共52頁(yè)，2023年5月2日，星期三病例：46，XX/46,XY異源嵌合體導(dǎo)致真兩性