原液穩(wěn)定性補(bǔ)充

重組人白細(xì)胞介素-12原液初步穩(wěn)定性研究試驗(yàn)對象1.1實(shí)驗(yàn)對象廣州市愷泰生物科技有限公司生產(chǎn)的重組人白細(xì)胞介素-12（rhIL-12）原液。1.2試驗(yàn)試劑及儀器見附錄一。重組人白細(xì)胞介素-12（rhIL-12）原液批號為：20131120。試驗(yàn)內(nèi)容2.1考察在生產(chǎn)貯存過程中對rhIL-12原液穩(wěn)定性的影響因素rhIL-12的分離提純都處于液體狀態(tài)，這對蛋白分子極不穩(wěn)定，純化后需在低溫（-80°C）冷凍貯存。在原液檢測及生產(chǎn)成品過程中，需要在室溫和2?8°C的條件下操作，并且樣品需要自冷凍狀態(tài)下解凍為溶液，故考察室溫、2C?8C的條件下原液的穩(wěn)定性及反復(fù)凍融對rhIL-12原液的蛋白含量、生物活性及純度影響。試驗(yàn)過程中樣品采用15ml無菌離心管包裝，批號為20131120。2.1.1溫度對rhIL-12原液穩(wěn)定性的影響取樣品分別放置于室溫（實(shí)驗(yàn)室溫度控制在21C?26C之間）、2C?8C（4C冰箱）。室溫放置的樣品在第0h、1h、2h、4h、8h、24h、48h取樣檢測，4C放置的樣品在0d、1d、2d、3d、4d、5d、10d和15d時取樣檢測。進(jìn)行樣品的蛋白含量、生物活性、HPLC純度和電泳純度測定，并分析這四個指標(biāo)隨時間的變化情況，樣品出現(xiàn)明顯變化后，停止取樣檢測。2.1.2多次凍融對rhIL-12原液穩(wěn)定性的影響rhIL-12原液在-80C、4C凍融多次，取樣進(jìn)行蛋白含量、生物活性、HPLC純度和電泳純度測定，并分析這四個指標(biāo)隨時間的變化情況?？疾祉?xiàng)目的檢測方法3.1蛋白含量方法見附錄四，參照13號申報(bào)材料《重組人白細(xì)胞介素-12制造和檢定規(guī)程草案》，蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為0時的80%-120%。3.2生物活性具體步驟見附錄二，參照13號申報(bào)材料《重組人白細(xì)胞介素-12制造和檢定規(guī)程草案》原液生物活性檢定標(biāo)準(zhǔn)，以國際參考品作為參考品，計(jì)算比活性，檢測各取樣點(diǎn)比活性不低于0時比活性的80%為合格。3.3高效液相色譜法（HPLC）純度檢測HPLC純度檢測方法見附錄三（二）。參照13號申報(bào)材料《重組人白細(xì)胞介素-12制造和檢定規(guī)程草案》原液純度檢定標(biāo)準(zhǔn)，純度不低于95%為合格。3.4電泳法（非還原SDS）純度檢測非還原SDS純度檢測方法見附錄五。參照13號申報(bào)材料《重組人白細(xì)胞介素-12制造和檢定規(guī)程草案》原液純度檢定標(biāo)準(zhǔn)，純度不低于95%為合格。3.3數(shù)據(jù)處理比較每批樣品各取樣點(diǎn)的蛋白含量、比活性和0時的蛋白含量、比活性，分析樣品的蛋白含量和活性變化。用重復(fù)測量的方差分析法，比較樣品隨時間變化的蛋白含量和生物活性差異，多重比較采用LSD法。使用SPSS13.0軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以XSD表示，顯著性為P<0.05。結(jié)果4.1影響因素試驗(yàn)結(jié)果4.1.1溫度對rhIL-12原液影響不同溫度條件下，各時間點(diǎn)樣品的蛋白含量、生物活性和純度的檢測結(jié)果見表1、表2及附圖1、圖2、圖3、圖4。

表1.室溫放置對rhIL-12原液蛋白含量、比活性及純度影響結(jié)果（X±SD,n=6）放置時-間比活性（x106lU/mg）含量（ug/ml）HPLC純度（%）電泳純度（%）實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格0h9.57+0.16合格198+18合格99.90合格99.9合格1h9.57±0.68合格197+13合格98.75合格99.9合格2h9.95+0.30合格198+20合格97.44合格99.9合格4h9.74±0.64合格190+09合格98.86合格99.9合格8h7.68±0.75**合格191+13合格98.56合格99.9合格24h6.55+0.23**不合格200+17合格99.00合格99.9合格48h4.35+0.32**不合格206+16合格98.92合格99.9合格注：**:與0h時比較P<0.01。由表1可知，室溫下放置的樣品，與0時樣品比活性相比，8h、24h和48h時樣品的比活性有顯著性差異（P<0.01），而1h、2h和4h時的樣品無顯著性差異，說明rhIL-12原液室溫條件下放置8h后比活性開始下降，但不低于0時比活性的80%，仍合格，至48h時已下降超過50%；樣品在各個取樣時間點(diǎn)的蛋白含量和純度均合格。表2.4°C放置對rhIL-12原液蛋白含量、比活性及純度影響結(jié)果（X±SD，n=6）放置時-間比活性（x106lU/mg）含量（ug/ml）HPLC純度（%）電泳純度（%）實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格0d9.67+0.19合格204+18合格98.63合格99.9合格1d9.41+0.12合格199+13合格99.31合格99.9合格2d9.53+0.30合格199+20合格95.10合格99.9合格3d9.34+0.26合格193+10合格96.15合格99.9合格4d9.79+0.49合格198+07合格95.45合格99.9合格5d9.79+0.45合格199+14合格97.01合格99.9合格10d9.65+0.24合格204+15合格97.58合格99.9合格15d6.58+0.39**不合格190+09合格99.22合格99.9合格注：**：與0h時比較P<0.01。由表2可知，與0時樣品比活性相比，4C放置10天之內(nèi)的各時間點(diǎn)樣品活性未出現(xiàn)顯著下降（P>0.05）；15d的樣品比活性與0時相比有顯著性差異（P<0.01），低于0時比活性的30%以上，不合格。樣品在各個取樣時間點(diǎn)的蛋白含量和純度均合格。4.1.2多次凍融對rhIL-12原液影響rhIL-12經(jīng)多次凍融后，其蛋白含量、生物活性和純度的變化見表3和附圖5、圖6。由表3可知，與初始樣品的比活性相比，rhIL-12原液在第5次凍融后有顯著性差異（P<0.01），說明rhIL-12經(jīng)5次凍融后生物活性下降，與初始樣品相比下降超過20%，6次凍融后比活性與初始樣品相比下降30%；樣品經(jīng)6次凍融后蛋白含量及純度均合格。表3.多次凍融對rhIL-12原液生物活性及純度影響結(jié)果（XSD，n=6）凍融次數(shù)比活性（x106IU/mg）含量（ug/ml）HPLC純度（％）電泳純度（％）實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格實(shí)測是否合格09.67±0.34合格197±11合格97.04合格99.9合格19.79±0.45合格185±11合格97.37合格99.9合格29.97±0.65合格198±17合格97.37合格99.9合格39.65±0.36合格190±08合格96.90合格99.9合格49.95±0.42合格188±17合格96.91合格99.9合格57.51±0.62**不合格206±15合格96.71合格99.9合格66.81±0.32**不合格193±10合格95.01合格99.9合格注：**：與凍融前比較P<0.01。結(jié)論rhIL-12原液生物活性受溫度影響較大，在生產(chǎn)過程中應(yīng)盡量避免在高溫環(huán)境下操作；多次凍融對rhIL-12的生物活性亦有較大影響，故其儲存應(yīng)考慮裝量，盡量使每個包裝的原液凍融后一次性用完，避免再次凍融造成失活和裝量不合適造成浪費(fèi)。牌］Z5［共1頁）樣品檢測報(bào)告律R冬爵3 lt-LS-2fl]51LSO-#W。-Oh蚣堪文忤? D；XEKhi:mElite'^Ekitaepeb*\Pr afat13賓哈記果*TL-12-20131炒口-!3布iC-Oh2013-技-M略dat去法立辟nD:\EZChroMEliteAEntsi:pciiseYPeojsets aul-tXNethod\2BQrar2!&LLL?Rst附圖1-2IL-12-20131l^O-SS'C-lht?^EZQltWTiDiX^ZChromEliteVEixierpEise\Pjects\Defaull\l[?th0d\28Dm^25u1.n.et血積百孫比附圖1-2IL-12-20131l^O-SS'C-lht?^EZQltWTiDiX^ZChromEliteVEixierpEise\Pjects\Defaull\l[?th0d\28Dm^25u1.n.et血積百孫比理jfe培訴觸fDAB〕1527ISD5ItiIIIS30]0660516 lOOuOnL 」4 %IDId*■wok信號a.weo詢訴路?時間雌面枳OHRWifr比仰論遂曲:娥（DM）16.20Q?L043731$.1|L5EMJM56gg.mi321總皴h30面A14mm心125C放置對rhIL-12原液HPLC純度影響（放置1h）樣品檜測報(bào)告佯此電禰n做據(jù)賣件;；EliteVEnterprisft\Projects\D>tfw11\Hata\20I3實(shí)瞼i己 IL-1^20iBL120-2E4C-lh20J3-12-273l-27-CH.dat方法文件，睡EE枳207578364003^第1頁（共】頁J樣品檢測報(bào)告棹品檔林棹品檔林I IL-12>2Clii3J1^25^0-2^顫握支件I DE\EZChr?MEliteXBntsrpri rojtrtsM>cf?jlt\Data\20]3^5IfcfeStML-32^20131120-25X：-2h20*19-32-2710;OP-2O,冊方佳京伸I b:\EZOirDnElit■訴；n*■rpxiaraXf1eojact^XDa-farule\M?EJ~c-d\2^Dm—2Eul.n.H-t& iW 14?'B'H 30M -WVWD:伯號A.280nn綸臬保踏"I。姓面積畫IS百分比J?ifriSS<k：1>aej43S-st^l-^t4271?04431S692.5050013.051645^75413T.44Ii798諾敗16385366L00.00I附圖1-425C放置對rhIL-12原液HPLC純度影響（放置4h）附圖1-4<15t（共】頁｝樣品檢測報(bào)告悍品者稗二 IL-12-2013]33D-25TCYhW■據(jù)文* EAElChraiElite-XEnteiprizeVPrnjecrtsWfsult(DMa\2Di玳瞼記錄\EL-12-2DI31J2D-2S'C-4h2DL3-J2-27】8-51-3瑁方ii文件a D:\ElChr<MnEliteXEnterpriseXProj*et*\tefault\MBthodXSSOtw-f&il,net4fl*4fl*V?；IB號4巳郭m蜻臬啤畝1間 歧面機(jī) 面機(jī)耳分噬 1里t它堪—〔口頌L6.05 532353 1713 觀LE.09 LT44BQ2? 通-叫 12D3總敷

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弟1員！共1瓦)樣晶檢測報(bào)告律品名稱= rL-!2-2DI3ll2fl-4'C4d蛟據(jù)文件' D：\ElChr(mElit*\ETrt*rpris*XPrej整ct#wLt'DM;叭20J4兵膝記錄口L-1A知1311SQ-fC擔(dān)2QI4-1-13l9-lB-D9Bdat方津.文件= B:YEIiZhronElite\Enterprisc1^rejects\Default\lfethDd\28Ctm.&25iiil-nttD 5315危有時Z5 3DM ?|VTO:信號Jl280rm保留葉閶峰面枳而福百分比通諂塔板敖CPAEJ15.391736T2635234.55既45&571?03總敝枷網(wǎng)21皿E1附圖2-6 4C放置對rhIL-12原液HPLC純度影響（放置5天）第I35（#I頁）樣品檢測報(bào)告樣品髭稱I EL-I2-20131120-4C6d拽據(jù)玄件工 O:\EZChrnnBlit機(jī)priseXProjects\DefailtlData\網(wǎng)14實(shí)攜記錄kD>I2-2013H20-4’口5d2014-1-1320-00-15.dat方注京件： P：\EZOitq?Eli-tc\En(tctpri3t\Projcc+rVIfef*ulthpd\280m-S&jlrpct￥1?:信號4280nn蠟果4R宙酎間J4面積血積苜分比理館塔根皺（DW15.32~535131Zu997291735762946297-513011 A教78SH043100.001

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樣品檢測報(bào)告樺品名稱I IL-12-20131120-dL2熟據(jù)文件： DAEZO^c?Elitc\EnterpriseXPrqJccttfault\Data\2013^己秉，ILTW?2Q131120?如?2!2013-I2-2T2>0&-2lrdat方法文伴； D:XEZOiromEliteXEiiterpriseYPirojfrctsXDcfaultYHethod\2SOm-2&11?art0 51D1,29 ?VWD:值號A,2E0nn保留時閭峰面積珂珥苜”tt理論塔根戴（D1BJ16.031S.0?43SI841724793697.377891795總敷100.DDO附圖3-4反復(fù)凍融對rhIL-12原液HPLC純度影響（凍融3次）弟1直C共1m1樣品檢測報(bào)告樺品*Wh IL-IS-S01樺品*Wh IL-IS-S0131120-<Sr-3蚣據(jù)文件： DsVEZOuromHlitcYEnterpn=e\Projactsault\Data\2t]1球felBift\IL-L2-201JL12a-dr-32013=12-21WULcht方祛文件a U：XETOiroifcFlitt\￡nt<rprist\Proj蛔t頃e■-21&gLwt■5-1 h 1 klid k15ak 44JWD：俏號A?知g保1密時佝嫉面粗IT稅百升比退論墀槌數(shù)0AK15.&SIS.Dg53306016做孺部I史W網(wǎng)’g為。ISD337176020100.00

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