血球計數(shù)板的使用

關(guān)于血球計數(shù)板的使用第1頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三①血球計數(shù)板的原理和構(gòu)造②方法與步驟

第2頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三①血球計數(shù)板的原理和構(gòu)造Ⅰ構(gòu)造血球計數(shù)板是一種專門用于計算較大單細胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個平臺。第3頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第4頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個大方格，其中只有中間的一個大方格為計數(shù)室。這一大方格的長和寬各為1mm，深度為0.1mm，其容積為0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的計數(shù)板。第5頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三1mm×1mm×0.1mm=0.1mm320mm×20mm×0.25mm=100mm3第6頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三25×16型的計數(shù)板計數(shù)池中央的大格又被雙線劃分成25個中格，其中的每個中格又被單線劃分成16個小格，中央大方格由25×16=400個小方格組成。第7頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三在血球計數(shù)板上，刻有一些符號和數(shù)字(見圖一)，其含義是：XB-K-25為計數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計數(shù)板分25個中格；0.10mm為蓋上蓋玻片后計數(shù)室的高；1/400mm2表示計數(shù)室面積是1mm2，分400個小格，每小格面積是1/400mm2。第8頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三把中央大方格的中方格再分成小方格的分割線并不只局限于中央大方格內(nèi)，而是一直延伸到正方形凹槽的邊緣，所以在其延長線上的4個大方格中分割線顯得密集。第9頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第10頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三25×16型的計數(shù)板一般計數(shù)四個角和中央的五個中方格（5×16=80個小方格）的細胞數(shù)。第11頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三Ⅱ血球計數(shù)板的原理第12頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算，對每個樣品計數(shù)三次，再取其平均值。N1=(n1-1+n1-2)/2N2=(n2-1+n2-2)/2N=(N1+N2+N3)/3N3=(n3-1+n3-2)/2第13頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三N1=(n1-1+n1-2)/2計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算。n1-1n1-2N1=(n1-1+n1-2)/2第14頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三N2=(n2-1+n2-2)/2計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算。n2-1n2-2N2=(n2-1+n2-2)/2第15頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三N3=(n3-1+n3-2)/2計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算。n3-1n3-2N3=(n3-1+n3-2)/2第16頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三將計數(shù)板及蓋玻片用流水沖洗，擦干，重復上述步驟，對每個樣品可計數(shù)三次，再取其平均值。N1=(n1-1+n1-2)/2N2=(n2-1+n2-2)/2N=(N1+N2+N3)/3N3=(n3-1+n3-2)/2第17頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三將同一樣品的計數(shù)結(jié)果，取平均值。代入下式，求算單胞藻的密度：N小格平均每小格內(nèi)的細胞數(shù)=N/(5×16)設(shè)每毫升中有x個單胞藻

x個N小格×16×25個1cm3(1mm×1mm×0.1mm÷1000)cm3x個=N/(5×16)

×16×25個1cm3(1mm×1mm×0.1mm÷1000)cm3x=N/(5×16)

×16×25個×1cm3×

1000÷(1mm×1mm×0.1mm)=50000N第18頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三②用血球計數(shù)板對藻細胞進行計數(shù)的方法與步驟：ⅰ檢查計數(shù)室先用顯微鏡對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢是否干凈。若有污物，則需用清水清洗，吹干，用擦鏡紙擦拭干凈。蓋玻片使用前浸在75%的酒精溶液中，使用時用眼科鑷取出，放在濾紙上吸水，用擦鏡紙擦拭干凈。將蓋有蓋玻片的計數(shù)板放在顯微鏡的載物臺上，調(diào)焦，用低倍鏡找到計數(shù)區(qū)檢查是否干凈。第19頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三從試管中吸出培養(yǎng)液進行計數(shù)之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使單胞藻分布均勻，防止單胞藻凝聚沉淀，提高計數(shù)的代表性和準確性，求得的培養(yǎng)液中的單胞藻數(shù)量誤差小。第20頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三注意，當藻液濃度高時，為了便于計數(shù)，可將藻液用消毒海水稀釋后進行計數(shù)。在計數(shù)有鞭毛或有運動性的藻類時，可先吸取定量的藻液，滴加魯哥氏碘液（1000毫升藻類用15毫升的魯哥氏液固定）進行固定，然后添加消毒海水稀釋后計數(shù)。第21頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三將計數(shù)板連同蓋玻片一起取下，用細口膠頭滴管吸取稀釋后的搖勻的單胞藻懸液，迅速將吸管尖靠在計數(shù)池上蓋玻片的邊緣，略擠膠頭滴管讓培養(yǎng)液利用液體的表面張力，自行滲入。第22頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第23頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第24頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第25頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第26頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第27頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三樣品流入的量以充滿蓋玻片下面的空間為宜，蓋玻片下面不能有氣泡存在，否則會造成計數(shù)不準。多余的藻液會流入H形的凹溝中。第28頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三樣品添加到計數(shù)池后，靜置5min。使藻細胞沉降，否則，細胞呈懸浮狀態(tài)，不處于同一平面上，給計數(shù)造成不便。待單胞藻全部沉降到計數(shù)室底部后，將計數(shù)板放在載物臺的中央，先在低倍鏡下找到計數(shù)室所在位置后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察，仔細調(diào)焦，同時調(diào)節(jié)光柵，必要時調(diào)節(jié)光源和反光鏡角度，直至細胞和縱橫格線都清楚。計數(shù)并記錄。第29頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三如果規(guī)格為25格×16格的計數(shù)板統(tǒng)計計數(shù)池中央大方格內(nèi)四角及中央中格內(nèi)(即80個小方格)的單胞藻數(shù)，并記錄。計數(shù)時，小心移動載物臺，從上到下，由左及右又由右及左依次計數(shù)各小格內(nèi)的細胞數(shù)。一般可采取“數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線”的原則處理。凡壓方格的上線和左線的細胞，統(tǒng)一算此方格內(nèi)的細胞，而壓方格的下線和右線的細胞，統(tǒng)一不算此方格內(nèi)的細胞。第30頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三第31頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三如果一個小方格內(nèi)單胞藻過多，難以數(shù)清，應(yīng)當對培養(yǎng)液進行稀釋以便于單胞藻的計數(shù)。具體方法是：搖勻試管，取1mL單胞藻培養(yǎng)液，加入成倍的無菌水（消毒海水）稀釋，稀釋n倍后，再用血球計數(shù)板計數(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)。以每小方格內(nèi)含有4—5個單胞藻細胞為宜。特別是在培養(yǎng)后期的樣液需要稀釋后計數(shù)。第32頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算，將計數(shù)板及蓋玻片用流水沖洗，吹干，擦凈，重復上述步驟，對每個樣品計數(shù)三次，再取其平均值。第33頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三N1=(n1-1+n1-2)/2計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算。n1-1n1-2N1=(n1-1+n1-2)/2第34頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三N2=(n2-1+n2-2)/2計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算。n2-1n2-2N2=(n2-1+n2-2)/2第35頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三N3=(n3-1+n3-2)/2計數(shù)一個樣品要從兩個計數(shù)室中計得的平均數(shù)值來計算。n3-1n3-2N3=(n3-1+n3-2)/2第36頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三將計數(shù)板及蓋玻片用流水沖洗，擦干，重復上述步驟，對每個樣品可計數(shù)三次，再取其平均值。N1=(n1-1+n1-2)/2N2=(n2-1+n2-2)/2N=(N1+N2+N3)/3N3=(n3-1+n3-2)/2第37頁，講稿共40頁，2023年5月2日，星期三將同一樣品的計數(shù)結(jié)果，取平均值。代入下式，求算單胞藻的密度：N小格平均每小格內(nèi)的細胞數(shù)=N/(5×16)設(shè)每毫升中有x個單胞藻

x個N小格×16×25個1cm3(1mm×1mm×0.1mm÷1000)cm3x個=N/(5×16)

×16×25個1cm3(1mm×1mm×0.1mm÷1000)cm3x=N/(5×16)

×16×25個×1cm3×

1000÷(1mm×1mm×0.1mm)=50000N第38頁，