免疫組織化學技術的原理及方法課件

免疫組織化學技術

的原理及方法

目錄一.基本知識二.基本原理三.方法四.結果的判斷及異常著色原因分析和對策五.臨床意義一、免疫組化技術的基本知識一、免疫組化技術的基本知識

免疫組化的基本概念

免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。一、免疫組化技術的基本知識

抗體與抗原能特異性結合—生物學結合是免疫球蛋白Ig

抗原兩個主要屬性：免疫原性及特異反應性，蛋白質具有抗原性免疫球蛋白的化學結構免疫球蛋白根據重鏈結構命名IgG(γ),IgA(α)，IgD(δ),IgE(ε),IgM(μ)五種免疫球蛋白只有兩種類型的輕鏈，即：

Kappa(κ)和Lambda(λ)

每個抗體分子的輕鏈必須相同；某一單獨的抗體分子決不可能既有κ鏈又有λ鏈。這一點在免疫組化的淋巴瘤診斷中十分重要。免疫球蛋白的化學結構

Fc(Fragmentcrystalline)是免疫球蛋白的羧基端，意為結晶片段，因其純化時呈結晶狀態(tài)而名之，該片段與抗原特異性有關

Fab(Fragment

antigenbingding)該端是抗體與抗原特異性結合的部位，每分子Ig能結合2個抗原分子

多克隆抗體與單多克隆抗體及其產生

多克隆抗體：多株B細胞針對多個抗原決定簇產生的抗體單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單株淋巴細胞（克隆）所產生的抗體多克隆抗體與單多克隆抗體及其產生多克隆抗體的產生以純化的抗原免疫動物而獲得，實際上是針對多個抗原決定簇的多個抗體組成，檢測范圍廣。在病理診斷中，有利劃歸腫瘤的基本類型。常用的多克隆抗體一般在兔身上產生，國外產品目錄上常以RaH（RabbitagainstHuman）表之。多克隆抗體亦可產生于羊、豬、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗體的動物來源種類，對后繼抗體的選用至關重要。多克隆抗體與單多克隆抗體及其產生單克隆抗體的產生應用細胞融合的雜交瘤（Hybridization），以針對單一抗原決定簇的小鼠與小鼠骨髓瘤細胞（腫瘤性B細胞）融合形成雜交瘤，其特點是既能產生特異性抗體，又能在體外無限地增殖。將瘤細胞在體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔內而獲單克隆抗體，由此產生的小鼠抗人（抗原）的抗體常以MaH表示，現在亦有兔的單克隆抗體?？乖闹苽洌簜鹘y(tǒng)用蛋白提純近來可應用分子生物學技術：已知抗原的基因結構，用其合成多肽，作為抗原，如ER、PR抗原的制備現有兔的單抗多克隆抗體的選用1、單克隆抗體的制備比多克隆抗體復雜，價格更貴；在應用中不一定比多克隆抗體好。2、單克隆抗體的特異性強，多克隆抗體則敏感性高，如何選用完全決定于使用的目的性。

標記抗體

1、在抗體上用化學方法聯接某種標記物，目的是使抗原抗體的結合能用肉眼觀察到2、標記物種類：熒光素：異硫氰酸熒光素或羅丹明酶：辣根過氧化酶，堿性磷酸酶金屬離子：膠體金顆粒3、標記的方法：化學性結合將降低抗體效價及標記物的活性，從而使染色敏感性降低酶—抗酶抗體復合物

通過免疫反應而不是化學方法，將酶結合到抗體上，形成具酶活性的免疫復合物。如PAP復合物（PeroxidaseAntiPeroxidaseComplex），PAP復合物屬非標記性，保護了酶的活性，比免疫熒光法敏感上千倍。酶標親和素在AB復合物中，酶是標記在生物素上，而后與親和素合成復合物。在標記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強的結合力，因此

LSAB法比ABC法更敏感

多聚物載體

1、核心是一種柔韌的多聚物，它能結合一抗和酶分子，起到載體的作用2、一步法多聚物載體試劑是多聚物結合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯結的由HRP標記的多聚物二、免疫過氧化物酶染色技

術的基本原理

免疫過氧化酶染色技術的

基本原理

顯色系統(tǒng)：三抗、酶、底物聯結系統(tǒng)：二抗識別系統(tǒng)：一抗、組織抗原識別系統(tǒng)1、特異性抗體識別組織或細胞中的靶抗原。特異性抗體具有識別并結合靶抗原的功能，這是本技術的理論依據所在2、特異性抗體品種繁多，應根據待檢測抗原的要求選用3、特異性抗體有的屬單抗，有的屬多抗，有的既有單抗又有多抗，可根據不同染色要求而選用4、識別系統(tǒng)的組成比較恒定，識別功能由特異的第一抗完成顯示系統(tǒng)1、也是顯色系統(tǒng)。抗體抗原的結合是肉眼看不見的，顯示系統(tǒng)的目的就是使這種看不見的反應變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位2、顯色系統(tǒng)由酶、底物加上顯色劑組成，最終可在標記位點形成有色分子的終末產物，若顯色劑為DAB，則出現棕褐色細顆粒沉淀

E(酶)+S(底物)→E?S(酶底物復合物)→P(反應產物)+E(酶)E(酶)可循環(huán)使用

顯示系統(tǒng)辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應過程:HRP+H2O2→HRP?H2O2→有色分子終末產物+HRPDAB（電子供體）HRP：酶H2O2：底物HRP?H2O2：酶?底物復合物顯示系統(tǒng)免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點在于顯色系統(tǒng)的差異：間接酶標法：利用標記于橋聯抗體的酶PAP法：利用PAP復合物ABC法：利用AB復合物LSAB法:利用直接標記于親和素的酶EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體

其目的都是設法提高免疫組化染色的敏感性聯結系統(tǒng)1、聯結或橋聯抗體（一般為第二抗體）2、按免疫學要求將識別系統(tǒng)與顯色系統(tǒng)聯結成為統(tǒng)一體3、應采用何種聯結抗體決定于特異性第一抗體是多克隆還是單克?。孩湃粢豢故嵌嗫寺】贵w，則二抗是羊或其它動物的抗兔血清；⑵若一抗是單克隆抗體，則二抗常是兔抗鼠的血清4、有的聯結抗體既能聯結多抗，亦能聯結單抗三、免疫組化染色方法的類別

免疫組化染色方法的類別

直接法間接法PAP法ABC法LSAB法一步法（EPOS）兩步法（Envision）直接法將熒光、酶、金直接標記在一抗上進行顯色，沒有聯結系統(tǒng)、未用橋抗體。優(yōu)點：特異性高、非特異染色輕。缺點：敏感性低，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標記間接法將標記物標記在橋聯抗體上（即二抗、三抗）一抗往往是兔身上產生的多克隆抗體，其酶標抗體必須是針對兔優(yōu)點：敏感性高，只需少數幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配缺點：特異性差PAP法

過氧化酶-抗過氧化酶法

組成：1、一抗是針對靶抗原的特異性抗體2、二抗是聯結抗體，一面聯結一抗，另一面聯結PAP復合物3、三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動物身上誘發(fā)產生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復合物（PAP）優(yōu)點PAP復合物中含酶更多，且是一種非標記的免疫組化方法，敏感性更高PAP復合物常來自兩種不同的動物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色可用于福爾馬林固定的石蠟切片ABC法

親和素-生物素法

組成：一抗、生物素化的二抗、ABC復合物（親和素+酶標生物素）優(yōu)點：1、親和素和生物素有強大親和力，使其比直接和間接酶標法更敏感，也超過PAP法。2、能用于常規(guī)石蠟切片。親和素—生物素復合物

1、親和素有四個生物素分子特異性結合部位，其結合力強，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結合2、親和素-生物素復合物是一個三維空間的結構，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產生多級放大，從而提高此生物反應的敏感性和特異性3、AB復合物多用于ABC法的免疫組化中LSAB（SP）法

標記的鏈霉親和素-生物素法

特點：將HRP直接標記于鏈霉親和素上優(yōu)點：1、更快速：空間結構更小2、更敏感：鏈霉親和素的親和性更強，更易于到達深部位點3、非特異背景更少：鏈霉親和素空間結構特殊，不易與高荷電的組織成分（膠原纖維、結締組織）聯結酶標親和素

在AB復合物中，酶是標記在生物素上，而后與親和素合成復合物。在標記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強的結合力，因此LSAB法比ABC法更敏感一步法（EPOS）及兩步（Envision）

特點：以多聚體為載體，聯結了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法）優(yōu)點：1、操作簡便，省時2、提高了敏感性和特異性3、減少了背景著色4、避免內源性生物素的干擾多聚物載體

一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKOEPOS及DAKOEnvision試劑核心是一種柔韌的多聚物，它能結合一抗和酶分子，起到載體的作用一步法多聚物載體試劑是多聚物結合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯結的由HRP標記的多聚物四、免疫組化染色結果的判

斷及異常著色的原因分析及

其對策

免疫組化染色結果的判斷

特異性著色具備特點1、特定的定位：特定的組織、特定的細胞、特定的細胞內的部位2、著色的不均一性：分布上的不均一、著色強度的不均一3、顆粒性顯色：DAB顯色劑應為棕黃到棕褐色CK染色，結腸腺癌細胞膜特異性著色

Kappa胞漿著色

TdT染色，胞核著色

PR胞核著色

ER胞核著色

免疫組化染色結果的判斷

對照的設置1、空白對照2、陽性對照3、吸收試驗對照4、替代對照5、自身對照異常著色（假陽性）原因及對策

異常著色原因：內源酶及內源性生物素、抗體本身原因、切片制作不當、沖洗不充分、DAB顯色產生背景著色假陰性的原因：抗原的丟失、抗原的遮蔽、抗體試劑因素、操作不當非特異性著色原因及對策

內源酶及內源生物素↓1、滅活過氧化物酶-----3%H2O22、滅活內源性生物素----蛋清封閉或更換不含生物素的染色系統(tǒng)3、滅活堿性磷酸酶異常著色原因及對策

抗原自身原因↓1、抗體不純----應用單克隆抗體2、標本中含有與靶抗原相似的抗原決定簇-----采用具更特異性抗原決定簇的單克隆抗體異常著色原因及對策

切片制作不當↓1、嚴重變性壞死及炎性病灶處2、切片裱貼不平3、褶皺處4、組織邊緣部異常著色原因及對策

1、清洗不充分→用含鹽的緩沖液充分沖洗，可利于減低背景著色2、DAB顯色產生背景著色→未除去DAB的不溶性顆粒、DAB保存不妥，其氧化產物沉淀在組織上非特異性背景著色原因及對策

電荷吸附→加二抗動物非免疫血清（牛血清也常用）假陰性的原因分析及對策

㈠抗原的丟失標本固定不及時、固定過久，浸蠟時間、溫度過高，均可將抗原性破壞㈡抗原的遮蔽1、福爾馬林固定石蠟包埋后，其抗原性因分子交聯而被遮蔽2、修復抗原，包括蛋白酶消化、微波加熱處理㈢抗體的因素1、有效性：一抗的特異性、效價、保存時間、保存條件及有無菌類污染2、抗體間的相互匹配：二抗與一抗、三抗與二抗不匹配，三抗必須是一抗同種動物來源的同型抗體㈣操作不當1、掉片2、消化了不該消化的靶抗原3、切片放置不平抗體流失4、遺漏重要的操作步驟（如漏加HRP的底物）5、顯色時間過短

解決方法：嚴格按照操作步驟進行五、臨床意義

近年來，隨著免疫組織化學技術的發(fā)展和各種特異性抗體的出現，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規(guī)腫瘤病理診斷中，5%-10%的病例單靠H.E.染色難以作出明確的形態(tài)學診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷