β-地中海貧血基因檢測(PCR-反向點雜交法20140929上午)

β-地中海貧血基因檢測（PCR-反向點雜交法）β地中海貧血是指β鏈的合成受部分或完全抑制的一組血紅蛋白病。因本病多為點突變，故常用PCR加反向點雜交(RDB)確定突變類型。我國各民族的β地貧基因突變情況有一定差異，南方漢族的突變基因以CD41-42(-TCTT)、CDL7(A→T)、IVS-Ⅱ-654(C→T)和TATAbox-28(A→G)為主，占85%～90%。1.掌握PCR技術(shù)原理及方法，熟悉其注意事項2.掌握反向點雜交技術(shù)原理及方法，熟悉其應(yīng)用【目的】PCR技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）是由美國PECetus公司的KaryMullis在1983年（1993年獲諾貝爾化學(xué)獎）建立的。這項技術(shù)可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應(yīng)就將特定的DNA片段擴(kuò)增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術(shù)在分子生物學(xué)研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學(xué)的研究進(jìn)展。它不僅是DNA分析最常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達(dá)、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價值。

【原理】PCR技術(shù)原理⑴PCR技術(shù)的基本原理：該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來啟動合成，通過一個或兩個人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成部分雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。

⑵PCR的反應(yīng)動力學(xué)：PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。

反向斑點雜交(reversedotblot，RDB)是Saiki等[1]提出的一種斑點雜交技術(shù)，該技術(shù)采用固化了多種特異性探針的膜條與擴(kuò)增靶序列雜交，使一次雜交即可同時篩查被檢DNA中的多種突變。這種以膜上固定探針取代固定靶DNA的方式，改變了傳統(tǒng)雜交法一次只能檢測一種突變的模式，具有快速、簡便、高敏感度和特異性強(qiáng)的特點，尤其在基因突變檢測、基因分型、病原體的檢測等領(lǐng)域有其獨(dú)特的優(yōu)勢。【原理】反向斑點雜交技術(shù)原理反向斑點雜交采用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行靶核酸的擴(kuò)增，將產(chǎn)物同固定在尼龍膜上的探針進(jìn)行雜交，一次雜交反應(yīng)可以檢測多種靶序列。該方法具有快速、簡便，高靈敏度和特異性的特點，廣泛應(yīng)用于病原體檢測、基因突變檢測、基因分型以及遺傳多態(tài)性檢測等多個方面，具有潛在的臨床應(yīng)用價值【操作步驟】1.DNA獲?。ㄒ褱?zhǔn)備好了）2.PCR擴(kuò)增：反應(yīng)液管（做好記號）5000rpm，2秒加入2ulDNA溶液總體積25微升PCR擴(kuò)增條件50℃，15min95℃，10min94℃，1min55℃，30sec72℃，30sec72℃，7min35cycles3.雜交：15ml管探針膜條（做好記號）A液5-6mlDNA溶液（PCR產(chǎn)物）25ul沸水浴10min42℃雜交1.5小時以上4.洗膜：50ml塑料管B液40ml42