生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)講座課件

第一部分色譜技術(shù)層析法也稱色譜法，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。1944年出現(xiàn)紙層析。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過(guò)固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。按層析過(guò)程的機(jī)理分類(lèi)：吸附層析：利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異，達(dá)到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。離子交換層析：利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。按操作形式不同分類(lèi)：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點(diǎn)樣后，用流動(dòng)相展開(kāi)，以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類(lèi)似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。第一節(jié)吸附層析技術(shù)一、基本原理吸附層析法（液-固色譜法，LSC）

原理：利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。特點(diǎn)：適合分離不同種類(lèi)的化合物(醇類(lèi)和芳香烴）。二、吸附劑吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等羥基羥基磷灰石（HA）[Ca10(PO4)6.(OH)2],可用于分離蛋白質(zhì)與核酸。其表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán)；酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與PO43-結(jié)合。HA柱層析最重要的用途之一是分離單鏈DNA和雙鏈DNA，因?yàn)樗鼘?duì)雙鏈DNA的親和力大于單鏈DNA。第二節(jié)分配層析技術(shù)分配層析法（液-液層析法，LLC）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動(dòng)相流過(guò)固定相。分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩相內(nèi)的濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)。K=c1/c2分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢。因此可彼此分開(kāi)。特點(diǎn)：液-液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)一、基本原理概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過(guò)裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過(guò)層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來(lái)。二、凝膠的種類(lèi)和性質(zhì)

一、交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)1)SephadexGG后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。

G反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。2）SephadeXLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)P37。二、瓊脂糖凝膠（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)

依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。

三、聚丙烯酰胺一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠—P（Bio-GelP).

四、聚丙乙烯凝膠（Styrogel)大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。三、凝膠過(guò)濾在試驗(yàn)室中的應(yīng)用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化2）分子量的測(cè)定3）分級(jí)分離4）溶液濃縮5）平衡常數(shù)的測(cè)定6）細(xì)胞及顆粒的分離酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；5%瓊脂糖，或在3%凝膠中加入20%CH2概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過(guò)裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中的分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；Acr（g）+Bis（g）3、重點(diǎn)提示：實(shí)驗(yàn)的原理及實(shí)驗(yàn)后的思考題均要熟悉，實(shí)驗(yàn)中所用重要試劑及其作用要熟悉，重要的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果要熟悉。凝膠層析：利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。尤其適于分離大片段DNA。原理：利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。另一相流過(guò)固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電1、范圍—本學(xué)期所做的所有實(shí)驗(yàn)及其內(nèi)容緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。最后真誠(chéng)歡迎對(duì)本課程及本人授課情況提出意見(jiàn)與建議！-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來(lái)，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類(lèi)型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。第四節(jié)離子交換層析法原理:根據(jù)離子交換樹(shù)脂對(duì)需要分離的各種離子的親和力不同而達(dá)到分離的目的。將離子交換樹(shù)脂裝入層析柱。離子交換樹(shù)脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，分子中含有可解離的基團(tuán).含有酸性可解離基團(tuán)的稱為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，可解離出H+，含有堿性可解離基團(tuán)的稱為陰離子交換樹(shù)脂，可解離出OH-。離子交換層析的基本原理++++++———++++++若選擇陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，則帶正電荷的物質(zhì)與H+發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。若選擇陰離子交換樹(shù)脂，則帶負(fù)電荷的物質(zhì)可與OH-發(fā)生交換而結(jié)合在樹(shù)脂上。物質(zhì)在樹(shù)脂上結(jié)合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當(dāng)?shù)南疵撘罕憧蓪⒒旌衔镏械慕M分逐個(gè)洗脫下來(lái)，達(dá)到分離純化的目的。++第五節(jié)親和層析法原理：利用生物大分子間特異的親和能力來(lái)純化生物大分子如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的DNA等。將待純化物質(zhì)的特異配體通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，通過(guò)洗脫雜質(zhì)即可除去。被結(jié)合的物質(zhì)再用含游離的相應(yīng)配體溶液把它從柱上洗脫下來(lái)。第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）特點(diǎn)：①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大,因而分辨率很高。②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。許多類(lèi)型的柱層析都可用HPLC來(lái)代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾等。第二部分離心技術(shù)離心機(jī)的使用及注意事項(xiàng)臺(tái)式高、超速離心機(jī)0.6-10萬(wàn)轉(zhuǎn)/分以上離心機(jī)制備性分析性分析性超速離心機(jī)普通離心機(jī)冰凍離心機(jī)臺(tái)式（或地面式）普通離心機(jī)大容量冰凍離心機(jī)小于0.6萬(wàn)轉(zhuǎn)/分高速冰凍離心機(jī)0.6-2.5萬(wàn)超速冰凍離心機(jī)2.5-8萬(wàn)或更高(分析性超速離心主要用于檢測(cè)大分子物質(zhì)的沉降特征和結(jié)構(gòu)等)概述由（4）可知，帶電粒子的泳動(dòng)速度受電場(chǎng)強(qiáng)度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場(chǎng)里泳動(dòng)速度不同，為了便于比較，常用遷移率m（或稱泳動(dòng)度，指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度）代替泳動(dòng)速度表示粒子的泳動(dòng)情況。上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響：角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒移動(dòng)距離短，比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時(shí)間，但速度劇變?nèi)菀桩a(chǎn)生對(duì)流擾亂。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來(lái)，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類(lèi)型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤(pán)球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.最后真誠(chéng)歡迎對(duì)本課程及本人授課情況提出意見(jiàn)與建議！瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨分配層析：利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。U=mα（6）持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠特點(diǎn)：適合分離不同種類(lèi)的化合物(醇類(lèi)和芳香烴）。最后真誠(chéng)歡迎對(duì)本課程及本人授課情況提出意見(jiàn)與建議！1)SephadexG和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度NH2NH以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。二、轉(zhuǎn)子離心管及選擇（一）離心管常見(jiàn)的玻璃離心管質(zhì)雖硬，但脆，不能承受超離心的壓力。用于超離心機(jī)轉(zhuǎn)子中的離心管分為塑料管及不銹鋼管兩類(lèi)。離心時(shí)樣品一般應(yīng)裝滿離心管，否則將可能因有氣泡而使管的外部受壓不均，造成離心管破裂，使轉(zhuǎn)子不平衡產(chǎn)生事故

（二）離心管帽超離心機(jī)所用離心管一般都附有管帽，離心時(shí)離心管需戴上管帽。（三）轉(zhuǎn)子及選擇主要有角轉(zhuǎn)子（Type）、水平轉(zhuǎn)子（sw）、垂直轉(zhuǎn)子（v）、區(qū)帶轉(zhuǎn)子（c）等幾種類(lèi)型。1、角轉(zhuǎn)子指離心管腔與轉(zhuǎn)軸成一定傾角的轉(zhuǎn)子，角度越大，沉降越結(jié)實(shí)，分離效果越好，相反，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉(zhuǎn)子中沉降時(shí)，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側(cè)會(huì)出現(xiàn)顆粒沉積，稱為“壁效應(yīng)”。最適合差速離心，強(qiáng)度大、方便，但加速或減速時(shí)，對(duì)樣品有攪動(dòng)。2、水平轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)子活動(dòng)管套內(nèi)的離心管，旋轉(zhuǎn)時(shí)隨著轉(zhuǎn)子的轉(zhuǎn)動(dòng)，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）時(shí)。顆粒在水平轉(zhuǎn)子中的沉降是沿管子方向的，梯度離心中顆粒沉降區(qū)帶橫過(guò)離心管，離心后區(qū)帶不必重新定位，但只有處于樣品區(qū)帶中心的顆粒才直接向管底沉降，其它顆粒則撞向壁的兩側(cè)，產(chǎn)生“壁效應(yīng)”，但受振動(dòng)和變速攪亂后對(duì)流現(xiàn)象小得多。3、垂直轉(zhuǎn)子角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒移動(dòng)距離短，比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時(shí)間，但速度劇變?nèi)菀桩a(chǎn)生對(duì)流擾亂。4、區(qū)帶轉(zhuǎn)子

已破碎的細(xì)胞沉淀（細(xì)胞核）上清液沉淀（細(xì)胞膜碎片、線粒體、溶酶體）上清液沉淀（核糖核蛋白體）上清液（可溶性組分）500g,10’10000g,10’100000g,3h第三部分電泳技術(shù)電泳的概念：帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中向相反電極移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresis）。電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國(guó)物理學(xué)家Re?ss進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)）。但電泳技術(shù)的廣泛應(yīng)用，則是在1937年用濾紙作為支持介質(zhì)成功地進(jìn)行紙電泳以后，特別是近幾十年以來(lái)，電泳技術(shù)發(fā)展很快，各種類(lèi)型的電泳技術(shù)相繼誕生，在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。

電泳的分類(lèi)原則上按電泳的原理來(lái)分，可分為二類(lèi)：自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒(méi)有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過(guò)程中的對(duì)流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類(lèi)型。按支持介質(zhì)種類(lèi)的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤(pán)球蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。以上二種類(lèi)型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒(méi)有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。引言③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測(cè)）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)引言第一節(jié)電泳的基本原理電泳是在電場(chǎng)的作用下而產(chǎn)生的物質(zhì)運(yùn)動(dòng)，不同的物質(zhì)在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動(dòng)速度不同進(jìn)而達(dá)到分離目的。

.若將帶凈電荷Q的粒子放入電場(chǎng)，則該粒子所受到的電荷引力為：

F引=EQ（1）在溶液中,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力F阻

F阻=6πrηV

當(dāng)F引=F阻時(shí)

EQ=6πrηV

V=

由上式可以看出,粒子的移動(dòng)速度(泳動(dòng)速度V)與電場(chǎng)強(qiáng)度(E)和粒子所帶電荷量(Q)成正比,而與粒子的半徑(r)及溶液的粘度(η)成反比。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過(guò)程中受到更大的阻力，即粒子的泳動(dòng)速度與粒子形狀有關(guān)。EQ6πrη（2）（3）（4）電泳的基本原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類(lèi)和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。

+-由（4）可知，帶電粒子的泳動(dòng)速度受電場(chǎng)強(qiáng)度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場(chǎng)里泳動(dòng)速度不同，為了便于比較，常用遷移率m（或稱泳動(dòng)度，指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度）代替泳動(dòng)速度表示粒子的泳動(dòng)情況。

m=V/E=Q/6πrη（5）

由上式可以看出，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量，粒子大小及溶液粘度有關(guān)而與電場(chǎng)強(qiáng)度無(wú)關(guān)。EQ6πrη（4）V=電泳的基本原理由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度α隨溶液pH變化而不同，所以實(shí)際上常使用有效遷移率。有效遷移率U為遷移率m和當(dāng)時(shí)條件下電離度α的乘積。

U=mα（6）

將（6）式代入（5）式得：

U=

（7）

.Qα.6πrη由（7）式可以看出，凡能影響溶液粘度η的因素如溫度，影響分子帶電量Q及解離度α的因素如pH的改變，都會(huì)對(duì)有效遷移率，產(chǎn)生影響。電動(dòng)電勢(shì)，溶液的離子強(qiáng)度越高，由于溶液中的離子會(huì)分擔(dān)大沉淀（核糖核蛋白體）由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度α隨溶液pH變化而不同，所以實(shí)際上常使用有效遷移率。角式轉(zhuǎn)子的特殊形式，主要用于等密度梯度離心，這種轉(zhuǎn)子顆粒移動(dòng)距離短，比水平式和角式轉(zhuǎn)子節(jié)約大量時(shí)間，但速度劇變?nèi)菀桩a(chǎn)生對(duì)流擾亂。③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測(cè)）。依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。對(duì)于分子量較大的樣品，如大分子核酸、聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。最適合差速離心，強(qiáng)度大、方便，但加速或減速時(shí)，對(duì)樣品有攪動(dòng)。N,N’-甲叉雙丙烯酰胺將（6）式代入（5）式得：5%瓊脂糖，或在3%凝膠中加入20%吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，與待分離物質(zhì)的極性官能團(tuán)作用。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨對(duì)于分子量較大的樣品，如大分子核酸、當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%時(shí)，5%的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到原理：利用生物大分子間特異的親和能力來(lái)純化生物大分子如：抗原和抗體；電泳的基本原理

以上討論的是在溶液中進(jìn)行的自由界面電泳的情況，在用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電滲（是指在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)）的影響。電泳時(shí)應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。最后要考慮選用離子強(qiáng)度適宜的溶液。離子強(qiáng)度影響粒子的電動(dòng)電勢(shì)，溶液的離子強(qiáng)度越高，由于溶液中的離子會(huì)分擔(dān)大部分電流，則粒子的電動(dòng)電勢(shì)越小，泳動(dòng)速度越慢，反之越快?？傊?，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強(qiáng)度多種因素的影響。

第二節(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectropho-resis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acry-lamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis）在催化劑作用下合成的。聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類(lèi)型。一、概述CH2=CHC=ONH2CH2=CH

C=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、聚丙烯酰胺凝膠的制備

聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：

1.化學(xué)聚合化學(xué)聚合的催化劑通常采用過(guò)硫酸銨（ammoniumpersulfate，Ap），此外還需要加速劑TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量TEMED的加入，可使過(guò)硫酸銨形成自由基：

S2O82-2SO4-

這些自由基的產(chǎn)生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應(yīng)，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。.

光聚合通常用核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無(wú)色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應(yīng)。TEMED的存在，可以加速聚合。上述聚合反應(yīng)受許多因素的影響：（1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長(zhǎng)的增加。在進(jìn)行化學(xué)聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。（2）低溫、低pH都會(huì)減慢聚合反應(yīng)速度。（3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機(jī)玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應(yīng)。2.光聚合凝膠的物理性質(zhì)如機(jī)械強(qiáng)度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。凝膠總濃度（T）和交聯(lián)度（C）的計(jì)算公式分別為：T=C=

凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔徑越小。凝膠濃度過(guò)大，膠硬而脆，易折斷。濃度過(guò)小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。當(dāng)凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%時(shí)，凝膠具有最小孔徑，超過(guò)5%或低于5%時(shí)凝膠孔徑都要增大。三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系A(chǔ)cr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100%在濃度為7.5%的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%凝膠稱為標(biāo)準(zhǔn)膠。對(duì)于一個(gè)未知樣品，常用7.5%的標(biāo)準(zhǔn)膠或4%-10%的凝膠梯度來(lái)測(cè)試，而后選出適宜的凝膠濃度。用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%的大孔凝膠，此時(shí)凝膠太軟，不易操作，可加入0.5%瓊脂糖，或在3%凝膠中加入20%蔗糖以增加機(jī)械強(qiáng)度而又不影響凝膠孔徑大小。四、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

3.在電場(chǎng)中形成不連續(xù)的電位梯度。在這樣一個(gè)不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，由于這三種物理效應(yīng)，使樣品分離效果好，分辨率高。8.38.38.96.7水平板式電泳槽垂直板式電泳槽電泳條帶等電聚焦電泳，雙向電泳等類(lèi)型。Acr（g）+Bis（g）電泳現(xiàn)象早在十九世紀(jì)初就已發(fā)現(xiàn)（1808年俄國(guó)物理學(xué)家Re?ss進(jìn)行了世界上第一次電泳實(shí)驗(yàn)）。由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度α隨溶液pH變化而不同，所以實(shí)際上常使用有效遷移率。上清液（可溶性組分）S2O82-2SO4-原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。2）SephadeXLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)P37。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過(guò)層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；凝膠具有最小孔徑，超過(guò)5%或低于5%時(shí)凝膠孔徑都要增大。三、聚丙烯酰胺概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過(guò)裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。三、聚丙烯酰胺電動(dòng)電勢(shì)，溶液的離子強(qiáng)度越高，由于溶液中的離子會(huì)分擔(dān)大瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。m=V/E=Q/6πrη（5）特點(diǎn)：①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大,因而分辨率很高。三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。第三節(jié)瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對(duì)于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣，尤其適于分離大片段DNA。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。關(guān)于實(shí)驗(yàn)筆試部分的復(fù)習(xí)與考試1、范圍—

本學(xué)期所做的所有實(shí)驗(yàn)及其內(nèi)容2、復(fù)習(xí)材料—

實(shí)驗(yàn)講義有關(guān)部分及本課件3、重點(diǎn)提示：實(shí)驗(yàn)的原理及實(shí)驗(yàn)后的思考題均要熟悉，實(shí)驗(yàn)中所用重要試劑及其作用要熟悉，重要的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果要熟悉。4、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)雖然自己未全部做，但基本的讓要復(fù)習(xí)掌握。

完希望同學(xué)們認(rèn)真復(fù)習(xí)爭(zhēng)取取得好成績(jī)！最后真誠(chéng)歡迎對(duì)本課程及本人授課情況提出意見(jiàn)與建議！謝謝同學(xué)們！第三節(jié)凝膠過(guò)濾層析技術(shù)一、基本原理概念（排阻層析，分子篩層析）：當(dāng)生物大分子通過(guò)裝有凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過(guò)層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來(lái)。二、凝膠的種類(lèi)和性質(zhì)

一、交聯(lián)葡聚糖凝膠（Sephadex)1)SephadexGG后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。

G反應(yīng)凝膠的交聯(lián)程度、膨脹程度和分部范圍。2）SephadeXLH—20，是SephadexG—25的羧丙基衍生物，溶于水和親脂性溶劑，用于分離不溶于水的物質(zhì)P37。二、瓊脂糖凝膠（Sepharose;pharmacia;Bio-Gel(Blo-Rad)

依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。

三、聚丙烯酰胺一種人工合成的凝膠，以丙烯酰胺為單位，由甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。交聯(lián)劑越多，孔隙度越小。商品名為生物膠—P（Bio-GelP).

四、聚丙乙烯凝膠（Styrogel)大網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。第六節(jié)高壓液相層析（HPLC）特點(diǎn)：①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大,因而分辨率很高。②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。許多類(lèi)型的柱層析都可用HPLC來(lái)代替，如分配層析、離子交換層析、吸附層析、凝膠過(guò)濾等。③淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測(cè)）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調(diào)性差，并且由于其批號(hào)之間的質(zhì)量相差很大，很難得到重復(fù)的電泳結(jié)果，加之電泳時(shí)間長(zhǎng)，操作麻煩，分辨率低，實(shí)驗(yàn)室中已很少使用。④瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。⑤聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)引言電泳的基本原理由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度α隨溶液pH變化而不同，所以實(shí)際上常使用有效遷移率。有效遷移率U為遷移率m和當(dāng)時(shí)條件下電離度α的乘積。

U=mα（6）

將（6）式代入（5）式得：

U=

（7）

.Qα.6πrη由（7）式可以看出，凡能影響溶液粘度η的因素如溫度，影響分子帶電量Q及解離度α的因素如pH的改變，都會(huì)對(duì)有效遷移率，產(chǎn)生影響。電泳的基本原理

以上討論的是在溶液中進(jìn)行的自由界面電泳的情況，在用支持介質(zhì)的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電滲（是指在電場(chǎng)中，液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)）的影響。電泳時(shí)應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。最后要考慮選用離子強(qiáng)度適宜的溶液。離子強(qiáng)度影響粒子的電動(dòng)電勢(shì)，溶液的離子強(qiáng)度越高，由于溶液中的離子會(huì)分擔(dān)大部分電流，則粒子的電動(dòng)電勢(shì)越小，泳動(dòng)速度越慢，反之越快?？傊娪臼芰Ｗ颖旧泶笮?、形狀、所帶電量、溶液粘度、溫度、pH、電滲及離子強(qiáng)度多種因素的影響。

水平板式電泳槽垂直板式電泳槽部分電流，則粒子的電動(dòng)電勢(shì)越小，泳動(dòng)速度越慢，反之越快。5%的凝膠中，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)能得到聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1、范圍—本學(xué)期所做的所有實(shí)驗(yàn)及其內(nèi)容3、重點(diǎn)提示：實(shí)驗(yàn)的原理及實(shí)驗(yàn)后的思考題均要熟悉，實(shí)驗(yàn)中所用重要試劑及其作用要熟悉，重要的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和結(jié)果要熟悉。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。三、聚丙烯酰胺原理：利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。以后層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)氣相層析、高壓液相層析、薄層層析、親和層析、凝膠層析等。常見(jiàn)的玻璃離心管質(zhì)雖硬，但脆，不能承受超離心的壓力。NHNH2于凝膠總濃度（T）和Acr與Bis兩者之比。若將帶凈電荷Q的粒子放入電場(chǎng)，則該粒子所受到的電荷引力為：依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。1)SephadexG比網(wǎng)