第五章薄層色譜法

第五章薄層色譜法第1頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(2)1958年斯塔爾對(duì)薄層層析的吸附劑和涂鋪工具進(jìn)行了改革并使之標(biāo)準(zhǔn)化，克服了技術(shù)上的困難，從此以后，薄層層析法得到了迅速的發(fā)展。(3)1965年以后，聯(lián)邦德國(guó)和美國(guó)的藥典已將薄層層析列為標(biāo)準(zhǔn)方法。第2頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

(4)在我國(guó),1962年化學(xué)通報(bào)上發(fā)表了關(guān)于薄層層析的綜合報(bào)道,并在中草藥有效成分的分離和鑒定方面獲得了廣泛的應(yīng)用.

現(xiàn)在科研單位不但把薄層層析法作為分離和分析的手段，許多工廠也把薄層層析廣泛的用在反應(yīng)終點(diǎn)控制、工藝條件的選擇、產(chǎn)品質(zhì)量的控制和未知試樣的解剖。第3頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月薄層層析有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.快速做一次薄層層析只需要10－20min,而做一次紙層析需要數(shù)小時(shí)。

2.分離效率高薄層層析可使性質(zhì)相似的物質(zhì)如同系物或異構(gòu)體分離，其分離效率比紙層析高100－1000倍。

3.靈敏度高薄層層析可檢出0.01ug的物質(zhì)比紙層析高100倍。第4頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.顯色方便可以噴各種顯色劑，甚至可以噴強(qiáng)腐蝕性的濃硫酸，可以高溫灼燒，這些都是紙層析所不允許的。

5.應(yīng)用面廣可以進(jìn)行定性鑒定，也可以進(jìn)行定量測(cè)定。由于上述種種特點(diǎn)，薄層層析法得到日益廣泛的應(yīng)用和迅速的發(fā)展。第5頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月薄層層析法的分類和原理根據(jù)薄層層析所依據(jù)的分離原理可以把薄層層析分為吸附薄層層析、分配薄層層析、離子交換薄層層析和分子排阻薄層層析等，其中最常用的是吸附薄層層析，現(xiàn)以最常見的吸附薄層層析為例介紹其原理：

第6頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

溶劑前沿

斑點(diǎn)A

斑點(diǎn)B

bal

點(diǎn)樣線原點(diǎn)第7頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月各斑點(diǎn)在薄層中的相對(duì)位置

AB為了應(yīng)用方便,通常乘以100,用HRf表示

HRf=100Rf第二節(jié)薄層層析用的吸附劑和薄層

1.吸附劑選擇合適的吸附劑和展開劑是薄層層析第8頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月能否獲得成功的關(guān)鍵．吸附劑和展開劑的選擇要結(jié)合被分離樣品的性質(zhì)來(lái)進(jìn)行。薄層層析中的吸附劑和柱層析相似，首先應(yīng)該考慮應(yīng)如何層析，一般的講，非極性或弱極性的組分的分離用吸附層析，水溶性組分的分離用分配層析。常用的吸附劑：（1）氧化鋁氧化鋁鋪層時(shí)一般不加粘合劑，直接用干第9頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月粉鋪層，得到的層析板稱為“干板”或“軟板”，但也可以加煅石膏作粘合劑，這種混有煅石膏的吸附劑稱為氧化鋁G，用氧化鋁G加水，調(diào)成糊狀，鋪層活化后的層析板稱為“硬板”。干法鋪層的氧化鋁是150－200目，相當(dāng)于顆粒直徑75－100μm,濕法鋪層250－300目（相當(dāng)于顆粒直徑50－60μm）吸附劑的顆粒直徑大小對(duì)分離效果和層第10頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月析速度均有影響，顆粒太粗，層析展開速度較快，分離效果不好。顆粒太細(xì)，層析展開速度太慢，太細(xì)的吸附劑用干法鋪層就有困難。（2）硅膠硅膠是一種酸性吸附劑,具有良好的分離能力。但機(jī)械性能較差,必須加入粘合劑后方能用于薄層層析，常用的粘合劑是煅石膏、聚乙烯醇、淀粉、羧甲基纖維素酸鈉等，薄第11頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月層層析用硅膠的粒度為250－300目。硅膠H不含粘合劑,使用時(shí)需要另外加入。硅膠G硅膠和石膏(13－15％)混合而成。硅膠GF254

硅膠中既含有粘合劑石膏又含有熒光指示劑，在254nm的紫外線照射下呈現(xiàn)出黃綠色熒光。硅膠HF254＋366

硅膠中不含有粘合劑石膏,只含有熒光指示劑,這種熒光指示劑在254nm和366nm的紫外線照射下均能出現(xiàn)熒光。第12頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常用的熒光指示劑錳激活的硅酸鋅ZnSiO4?Mn,在254nm的紫外線燈照射下能夠產(chǎn)生熒光;銀激活的ZnS和CdS,ZnS?CdS?Ag在366nm的紫外線照射下能夠產(chǎn)生熒光。硅膠即可以進(jìn)行吸附層析，又可以進(jìn)行分配層析，主要的區(qū)別是在于活化程度不同，前者活化程度高，后者活化程度低。（3）纖維素可在實(shí)驗(yàn)室制備，取脫脂棉或?yàn)V紙剪成小第13頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月塊加適量的5％的鹽酸，加熱煮沸3小時(shí)，冷卻過(guò)濾用水洗至無(wú)氯離子，用5％乙醇洗3次，再用乙醚洗一次，揮發(fā)除去溶劑后，于105°C活化2小時(shí)，篩取100－200目備用。（4）聚酰胺聚酰胺是一種具有酰胺結(jié)構(gòu)的高分子化合物，層析用的酰胺主要是錦綸（又稱尼龍），酰胺基上的羰基或胺基可與酚類、第14頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月或某些酸形成氫鍵而具有吸附作用，由于各化合物與錦綸形成氫鍵的能力不同，因此，聚酰胺對(duì)酚類、酮類、硝基苯衍生物及其某些酸具有選擇性吸附作用，分離性能良好。

2薄層層析板的制備目前所用的各種薄板可大致分類如下：普通板：加粘合劑－硅膠、氧化鋁不加粘合劑－氧化鋁、聚酰胺、纖維素第15頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

加工板：熒光板－加入熒光性物質(zhì)緩沖板－用不同pH值的緩沖溶液調(diào)糊酸堿板－用稀酸或稀堿溶液調(diào)糊實(shí)驗(yàn)室常用的是加粘合劑的普通板。不加粘合劑的稱為軟板（吸附劑在層析板上不牢固）。加粘合劑的板稱為硬板（吸附劑在層析板上較牢固）。制取的方法就是將吸附劑均勻涂鋪在玻璃板上成為薄層，制得的薄層應(yīng)光滑、厚度均勻（干燥后的厚度0.1－第16頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月0.2mm)薄板常用玻璃制成,其規(guī)格60cm×20cm的長(zhǎng)方形或20cm×20cm的正方形,微量薄板常用2.5cm×7.5cm的微型載玻片.一般氧化鋁多用于干法制成軟板,纖維素常用濕法制成軟板,而硅膠采用硬板.（1）軟板的制備:

軟板制備最簡(jiǎn)便的方法是用一根直徑為1-1.2cm的玻璃棒,根據(jù)薄層的厚度在玻璃棒上繞幾圈膠布,膠布的厚度0.3-0.5mm,將干第17頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月的吸附劑在玻璃板上攤開,玻璃板一端固定,防止玻璃板在推進(jìn)時(shí)移動(dòng),如下圖所示,用玻璃棒在玻板上將吸附劑沿一個(gè)方向推成薄層.第18頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

氧化鋁和硅膠可用這樣的干法制成軟板，而纖維素板可用2克纖維素，加入水6－8毫升，攪拌均勻，涂鋪在玻璃板上，在室溫下過(guò)夜，即可使用。（2）硬板的制備將吸附劑和粘合劑（石膏和淀粉）按一定比例調(diào)成糊狀，然后用特制的涂鋪工具在玻璃板上涂鋪成薄層，薄層厚度0.3－0.5毫米(活化后0.1-0.3mm)。第19頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常用的涂鋪方法：①傾倒法將吸附劑和粘合劑加水調(diào)成糊狀，將糊狀吸附劑傾倒在玻璃板上大致攤開，輕輕振動(dòng)玻璃板，使糊狀物均勻地分布于玻璃板上形成薄層，然后將其放置在水平臺(tái)上晾干。晾干后放在100－110度的烘箱中活化０.５小時(shí)以后，放在干燥器中備用。第20頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②刮層法刮層法是在水平臺(tái)面上放置鋪制薄層用玻璃板C，在玻璃板C兩側(cè)放置兩塊玻璃板A和B，A和B較C厚些，相差約0.3－0.5mm，將調(diào)制的糊狀吸附劑傾倒在玻璃板C的一端，用有機(jī)玻璃尺或邊緣光滑的玻璃板沿一個(gè)方向?qū)⑽絼┕纹?，晾干，活化備用。?1頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ACB③涂鋪器鋪層法常用的鋪層器是斯塔爾型涂鋪器，其使用方法見下圖:第22頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第23頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月目前在鋪層中經(jīng)常使用傾倒法鋪層，除了使用手工鋪層法之外，還有商品預(yù)制板出售，包括普通板和高效板，常見的有以玻璃板為載體的氧化鋁和硅膠板，以塑料片為載體的聚酰胺薄膜。預(yù)制板質(zhì)量較高，使用方便。但國(guó)內(nèi)預(yù)制板的品種及規(guī)格較少，因此藥典中規(guī)定采用的均為手工制板。

第24頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常見的硬板有：①硅膠硬板以石膏為粘合劑，取市售硅膠G（G代表煅石膏，硅膠G含煅石膏15％）30g，加水60－80mL，滴加乙醇數(shù)滴防止氣泡產(chǎn)生，置研缽中調(diào)成糊狀，立即在玻璃板上涂鋪成薄層，晾干，活化備用。以淀粉為粘合劑取硅膠28.5g，加淀粉1.5g,混勻,加水75mL，置沸水浴上加熱，不斷攪拌到糊狀,然后均勻涂鋪在玻璃板上,晾第25頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月干，活化備用。②氧化鋁硬板取氧化鋁G（內(nèi)含煅石膏15％）25g，加水25mL,滴加乙醇數(shù)滴，置研缽中調(diào)成糊狀，然后涂鋪成均勻的玻璃板，室溫干燥后，根據(jù)需要于150－160度干燥1－3小時(shí)，備用。（3）薄層板的活化硅膠、氧化鋁的活性與其含水量有關(guān)，第26頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月含水量越低，吸附能力越強(qiáng)，其活度越高。因此層析板在使用之前必須經(jīng)過(guò)活化。對(duì)于硅膠薄層其活化溫度為105~110°C，氧化鋁薄層的活化溫度為150~200°C，活化后的薄層板在使用之前應(yīng)放在干燥器中備用。(4)常用的粘合劑及其使用濕法鋪層時(shí)需要加入粘合劑，常用的粘合劑有：煅石膏、羧甲基纖維素酸鈉（CMC）、淀粉和聚乙烯醇。第27頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月煅石膏用量是吸附劑用量的10－15％，煅石膏和吸附劑混勻后加水調(diào)成糊狀后鋪層。

CMC作粘合劑時(shí)，應(yīng)在CMC中加水使其溶解后配成0.5－1％的水溶液以供調(diào)糊使用。淀粉的用量約為吸附劑的5％，把吸附劑和淀粉加水調(diào)糊后，應(yīng)在85°C的水浴中，直接加熱數(shù)分鐘，使淀粉變得有粘性后再鋪層。第28頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

聚乙烯醇的用量為吸附劑的0.5－0.6％,把聚乙烯醇溶于水中配成0.3％的水溶液以供調(diào)糊使用。吸附劑調(diào)成糊狀時(shí)，用水量為吸附劑質(zhì)量的2－3倍，用傾倒法鋪層用水量應(yīng)多一些，吸附劑和水的質(zhì)量之比為1：3，用涂鋪器鋪層時(shí)，用水量應(yīng)少一些以1：2為好。鋪好的薄層，應(yīng)放在水平位置10－20min,待其凝固后放入烘箱，先在60－70°C第29頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月初步干燥，然后逐步升溫之105－110°C,活化半小時(shí)，保存在干燥器中備用。有的吸附劑在調(diào)糊時(shí)，易產(chǎn)生氣泡，必須設(shè)法除去，否則，在活化時(shí)氣泡破裂，形成小洞，影響分離。為了防止產(chǎn)生氣泡，在調(diào)糊時(shí)加入數(shù)滴乙醇。3.各種特制薄層

由于工作需要，各種特制薄層相繼出現(xiàn)，這里介紹數(shù)種：第30頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（1）混合薄層有兩種吸附劑混合制成。例如，為了降低硅膠的活度，可在其中加入一定量的硅藻土鋪層，也可以用硅膠：氧化鋁（1：1）鋪層，對(duì)糖和醇具有較好的分離效果。（2）酸堿薄層和pH緩沖薄層在分離生物堿和氨基酸時(shí)，為了得到更好的分離效果，可在分離時(shí)加入稀堿或稀酸，或緩沖溶液代替水制成薄層。第31頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（3）配合薄層用無(wú)機(jī)試劑如硝酸銀的水溶液代替水來(lái)鋪制的薄層叫配合薄層,在這種薄層上可使不飽和程度不同的脂肪酸得到分離,原因Ag+不和飽和脂肪酸形成配合物,Ag+和含有一個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸形成的配合物比含有兩個(gè)雙鍵的不飽和脂肪酸形成的配合物的穩(wěn)定性小,因此,在配合薄層上飽和脂肪酸移動(dòng)的最快,不飽和程度低的脂肪酸移動(dòng)的較慢,不飽和程度高的脂肪酸移動(dòng)的最慢。第32頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（4）涂布固定液的薄層（分配薄層）把固定相涂布在吸附劑上制成薄層，涂布方法有四種:①調(diào)糊法將固定相溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲兄瞥扇芤?，用這種溶液代替水與吸附劑混合調(diào)成糊狀，涂鋪薄層。②浸漬法把固定相溶于易揮發(fā)的有機(jī)溶劑中，配成一定濃度的溶液，把薄層浸入，取出，在空氣中放置使溶劑揮發(fā)，而固定相第33頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月留在薄層上，此法涂布固定相均勻。操作簡(jiǎn)單，但對(duì)于不太牢固的薄層，吸附劑易從玻板上脫落。③展開法把薄層的一端放在含有固定相溶液的層析缸中向上展開一次，此法涂布的固定相不均勻，薄層下端的固定相較多，越往上越少，但不影響分離。④噴霧法把含有固定相的溶液用噴霧器噴到薄層上，這種方法比較簡(jiǎn)單，但薄層固第34頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月定相分布不均勻。（5）具有濃縮區(qū)的薄層有兩種不同的硅膠鋪制而成，薄層前面的一段，即為濃縮區(qū)，它是由顆粒很大，比表面積很小，吸附能力很弱的硅膠鋪制而成，后面的一段薄層由一般的硅膠吸附劑鋪成，由于濃縮區(qū)的吸附劑極弱，在層析展開時(shí)，不論點(diǎn)樣情況如何，試樣中的各組分都迅速移動(dòng)至溶劑前沿，于是第35頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月在薄層交界處形成濃縮帶，然后進(jìn)入第2種薄層進(jìn)行展開。利用這種薄層點(diǎn)樣非常方便，分離效果也大大改善。（6）高效薄層它是由顆粒很小的硅膠和高度惰性的粘合劑鋪制而成的質(zhì)地十分致密、平滑的高效薄層預(yù)制板，這種薄層預(yù)制板性能十分穩(wěn)定，層析展開時(shí)斑點(diǎn)不擴(kuò)散，不拖尾，分離清晰，分離效果好。第36頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（7）熒光薄層在制備薄層時(shí)，可在吸附劑中加入熒光性物質(zhì)制成熒光薄層進(jìn)行分離，由于在紫外線燈照射下，整個(gè)薄層顯現(xiàn)出熒光，而樣品斑點(diǎn)處對(duì)紫外線能夠產(chǎn)生吸收，不顯熒光，故可檢出斑點(diǎn)的位置。常用的無(wú)機(jī)熒光性物質(zhì)是錳激活的硅酸鋅ZnSiO4?Mn，在254nm的紫外線燈照射下能夠產(chǎn)生熒光；銀激活的ZnS和CdS，第37頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月ZnS?CdS?Ag在366nm的紫外線照射下能夠產(chǎn)生熒光。制備無(wú)機(jī)熒光薄層的方法是在吸附劑中加入1.5%無(wú)機(jī)熒光性物質(zhì)，混合均勻調(diào)成糊狀鋪層。常用的有機(jī)熒光性物質(zhì)是熒光素鈉，可在薄層上用噴霧器噴0.04％的熒光素鈉的水溶液。第三節(jié)薄層層析展開劑的選擇

1.展開劑的選擇原則作為展開劑的要求：沸點(diǎn)低、較高的純度、第38頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性、粘度低和低毒性。薄層層析中使用最多的是吸附薄層層析，因此我們主要介紹吸附薄層中展開劑的選擇.在吸附薄層層析中，樣品的分離是由于不同組分與吸附劑的吸附與解析能力的不同引起的，分離的效果主要取決于吸附劑的極性、被分離物質(zhì)的極性和展開劑的極性。stahl設(shè)計(jì)了一個(gè)用于選擇薄層層析條件的簡(jiǎn)圖(三角圖形法)第39頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第40頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

由于吸附劑的選擇有限，樣品已經(jīng)給定，因此選擇合適的展開劑就是分離能否獲得成功的關(guān)鍵,三角圖形法僅僅提供了選擇展開劑的原則,展開劑選擇時(shí)首先要查閱文獻(xiàn)，在前人文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上再進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)就可以選擇到合適的展開劑。2.展開劑的選擇方法

(1)試驗(yàn)方法第41頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月①微量圓環(huán)技術(shù):在沒有合適的展開劑參考時(shí)，可以首先要選擇單一溶劑作展開劑，然后再選擇組合溶劑。單一溶劑組分簡(jiǎn)單，操作方便，分離選擇性好。溶劑的選擇可采用微量圓環(huán)技術(shù)應(yīng)用微量圓環(huán)技術(shù)可簡(jiǎn)便快速的比較出被分離物質(zhì)所在展開劑中的移動(dòng)速度和最后所得到的分離結(jié)果。第42頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月如下圖所示為顯微鏡載玻片制成的微型薄層，在微型薄層上點(diǎn)上幾個(gè)樣品，用吸管吸取少量溶劑于薄層斑點(diǎn)上進(jìn)行展開，觀察被分離物質(zhì)的分離情況。1－用環(huán)己烷進(jìn)行展開;2－用苯進(jìn)行展開;3－用氯仿展開

第43頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

②微型薄層可用小玻片鋪成薄層，點(diǎn)上試液，用各種認(rèn)為可能應(yīng)用的展開劑進(jìn)行展開試驗(yàn)，從而選擇適當(dāng)?shù)恼归_劑，再應(yīng)用于一般薄層，用微型薄層材料和時(shí)間都比較節(jié)省。（2）展開劑的選擇方法

①一般先選擇單一溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，然后再選擇兩種混合溶劑進(jìn)行試驗(yàn)。例如在硅膠薄層上分離生物堿時(shí)，可先用環(huán)己烷、苯、氯仿等單一溶劑，再用混合溶劑。如苯：氯仿（9：1或1：1）第44頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②如果兩種混合溶劑分離效果還不夠好，可以考慮加入第三種或第四種組分的混合溶劑.最后加入的第三種或第四種組分的目的是改變展開劑的極性，調(diào)整展開劑的酸堿性，以增大試樣的溶解度，從而改變分離效果。③一般的講，結(jié)構(gòu)類似的同系物往往可采用相同組分的展開劑。第45頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

例如，在中性氧化鋁上分離氨基蒽醌、甲基氨基蒽醌的各種異構(gòu)體時(shí)都可用環(huán)己烷：丙酮（3：1）的混合溶劑為展開劑。展開劑的選擇盡管非常麻煩，但前人已經(jīng)做了大量的工作，同系物或結(jié)構(gòu)類似的化合物的分離可以選擇相同組分或相似組分的展開劑，因此我們的工作已變得非常簡(jiǎn)單，只要查閱文獻(xiàn)或資料，然后再經(jīng)過(guò)試驗(yàn)就可以選擇合適的展開劑。第46頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）選擇和使用展開劑注意事項(xiàng)：

①展開劑要有一定的純度。有時(shí)展開劑中的少量雜質(zhì)如乙醚中含有少量水或氯仿中含有1％的乙醇等，可大大改變展開劑對(duì)混合物的分離能力，所以選擇展開劑時(shí)一定要注意試劑的規(guī)格和生產(chǎn)廠家，否則難以得到重復(fù)的結(jié)果。

②配制多元展開劑時(shí)，各溶劑的體積必須準(zhǔn)確加入。加入少量酸、堿或其它溶劑，需用刻度吸管或微量注射器。第47頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③多元展開劑中各種溶劑的沸點(diǎn)相差較大時(shí)，應(yīng)該臨時(shí)配制，并且不能重復(fù)使用，以免展開劑的比例改變，影響分離效果。

④配制兩種不混溶的展開劑時(shí)應(yīng)在分層后再使用，但在某些時(shí)候，展開劑中需要一定含水量，用水飽和展開劑后，應(yīng)立即分離出帶渾濁的有機(jī)溶劑層。第48頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

⑤選擇的展開劑最好是價(jià)格便宜、毒性小、揮發(fā)度適中，而且是容易購(gòu)得的普通溶劑。第四節(jié)薄層層析的操作方法和展開方式

1.幾種特殊形狀的薄層為了提高分離效果，縮短分離時(shí)間，可以改進(jìn)薄層的形狀（1）徑向薄層－可以使兩個(gè)Rf相近的組分獲得較好的分離效果。第49頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月徑向薄層層析點(diǎn)樣量可以多一些，展開后呈放射狀，分離清晰第50頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（2）圓形薄層－可以縮短展開時(shí)間第51頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）S形薄層－增加展開距離

2.點(diǎn)樣（1）點(diǎn)樣儀器：定性－毛細(xì)管；定量－微量注射器;制備分離：滴管。（2）樣品溶液常把樣品溶于氯仿、甲醇、乙醇等易揮發(fā)溶劑中，以便點(diǎn)樣后溶第52頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月劑迅速揮發(fā)，減少空氣中水分對(duì)吸附劑活度的影響；如果樣品為水溶液，為了加快點(diǎn)樣速度，如該化合物遇熱不分解，點(diǎn)樣后可以用紅外線燈干燥。（3）點(diǎn)樣量點(diǎn)樣量應(yīng)根據(jù)薄層厚度而定，一般來(lái)講，對(duì)于厚度0.2mm左右的薄層，定性檢出時(shí)，點(diǎn)樣體積為1－10μL，定量測(cè)定時(shí)點(diǎn)樣體積為50－100μL。（4）點(diǎn)樣方式和紙層析一樣，樣品應(yīng)第53頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

a.一般點(diǎn)樣b.點(diǎn)成條狀c.點(diǎn)成溝槽點(diǎn)成直徑為2－3mm的圓點(diǎn)，下面介紹幾種特殊的點(diǎn)樣方式：第54頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

3.展開方式展開方式有上行近水平展開、上行展開、下行展開、環(huán)形展開、雙向展開。

(1)對(duì)于軟板，只能采用近水平展開

(2)對(duì)于硬板，可以采用各種展開方式。①上行法（同紙層析）②下行法（同紙層析）第55頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月③二次展開對(duì)于組成比較復(fù)雜的樣品，一次展開不能使各組分分離完全，可在第一次展開后，將薄層板從層析缸中取出，讓溶劑揮發(fā)逸去然后再放入層析缸中，用另一種溶劑或同一種溶劑進(jìn)行第二次展開。④連續(xù)展開－試樣中的某些組分比移值較小且分離困難時(shí)，可采用連續(xù)展開。上行法連續(xù)展開,是在特制的層析缸中使薄層的頂部敞于外界,當(dāng)展開劑上升至薄層頂?shù)?6頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月端即不斷向外界揮發(fā)時(shí)，展開可連續(xù)進(jìn)行。下行法連續(xù)展開，是讓展開劑連續(xù)移動(dòng)至薄層底部然后滴落至層析缸內(nèi)。⑤雙向展開－對(duì)于組成極其復(fù)雜的樣品雙向展開法可以獲得較好的分離效果。第57頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.薄層層析注意事項(xiàng)

(1)層析缸應(yīng)放在水平平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，缸底平正，層析板各部分的傾角應(yīng)保持一致，以保持展開劑前沿較整齊規(guī)則。

(2)層析缸除特殊的要求外應(yīng)密閉不漏氣。使層析在展開劑蒸氣飽和的條件下進(jìn)行展開。

(3)薄層展開時(shí)層析缸內(nèi)展開劑蒸氣飽和問(wèn)題。

(4)溫度對(duì)吸附薄層層析的影響較小，但對(duì)第58頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月分配薄層層析的影響較大，因此在分配薄層層析中保持溫度的恒定是必要的。第五節(jié)薄層層析的定性檢出

在薄層展開后，把薄層板從層析缸中取出，用鉛筆在溶劑前沿畫線，對(duì)于有色物質(zhì)測(cè)量斑點(diǎn)的比移值即可進(jìn)行定性分析，對(duì)于無(wú)色物質(zhì)可用物理的或化學(xué)的方法使之顯色。

1.顯色方法和顯色劑

(1)顯色方法第59頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月常用的顯色方法有三種：①在紫外線燈下觀察；②蒸氣熏使之顯色；③噴各種顯色劑。

①在紫外線燈下觀察常用的紫外線燈是一種汞燈，它一般有兩種濾光片，一種能透過(guò)254nm的紫外光，另一種能透過(guò)366nm的紫外光。第60頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

把展開的薄層放在紫外線燈下觀察，含有共軛雙鍵的有機(jī)物能吸收紫外光呈現(xiàn)暗斑。如果采用硅膠GF涂鋪薄層，在紫外燈的照射下整個(gè)薄層呈現(xiàn)出黃綠色的熒光，斑點(diǎn)部分變暗，由于在紫外線停止照射后，熒光消失，所以在觀察到斑點(diǎn)位置后，應(yīng)用針在斑點(diǎn)周圍刺孔做出記號(hào)。第61頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月②蒸氣熏使之顯色。常用的試劑有I2、濃NH3·H2O、液體Br2，進(jìn)行顯色時(shí)，把這些易揮發(fā)的試劑裝在密閉的容器中，使它們的蒸氣充滿整個(gè)容器，將已展開并揮發(fā)除去溶劑的薄層放在其中，使之顯色。③噴各種顯色劑噴霧顯色時(shí)應(yīng)將顯色劑配成一定濃度的溶液，然后用噴霧器均勻的噴灑在薄層上，噴霧時(shí)，噴霧器與薄層之間的距離應(yīng)在0.7-1m之間。第62頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

(2)顯色劑顯色劑的種類很多，大致可分為兩類：通用顯色劑和專屬性顯色劑①通用顯色劑對(duì)于未知物的檢驗(yàn)，可以首先考慮通用顯色劑，這類顯色劑是利用它與被分離組分的氧化還原反應(yīng)，脫水反應(yīng)，酸堿反應(yīng)等顯色的，常用的顯色劑有下面幾種：?濃硫酸或50％的硫酸溶液大多數(shù)有第63頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月機(jī)化合物噴以此種顯色劑后會(huì)出現(xiàn)棕色到黑色斑點(diǎn)，這種焦化斑點(diǎn)常常會(huì)出現(xiàn)熒光?酸堿指示劑例如噴以0.3%溴甲酚綠的80％的甲醇溶液，在綠色背景上呈現(xiàn)黃色斑，表示脂肪族羧酸的存在。?5％磷鉬酸的乙醇溶液噴后于120°C烘烤，還原性物質(zhì)呈藍(lán)色斑，再以氨水熏之，背景變?yōu)闊o(wú)色。第64頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月?熒光顯色劑薄層展開后,噴以熒光顯色劑溶液，然后在紫外光燈下觀察,不同的物質(zhì)能在熒光背景下呈現(xiàn)出不同顏色的斑點(diǎn)。常用的熒光顯色劑有：0.2％的二氯熒光素，0.01％的熒光素乙醇溶液,0.1％的桑色素乙醇溶液，0.05％的羅丹明B乙醇溶液。②專屬性顯色劑是指能使某一類或少數(shù)幾類官能團(tuán)或化合物顯色的試劑。例如第65頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月?2％2、4－二硝基苯肼乙醇溶液噴后在120°C加熱10min，醛酮在黃橙色背景下顯紅色或橙色斑。?Dragendroff試劑改良后的配方有堿式硝酸鉍、酒石酸溶液和KI溶液混合配成，用來(lái)檢出生物堿和其它含氮化合物。?Ehrlich試劑4－二甲基氨基苯甲醛溶液用來(lái)檢出胺類化合物。?0.3％的茚三酮的乙醇溶液用來(lái)檢出第66頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸及脂肪族伯胺化合物，在白色背景上顯粉紅色到紫色斑。?FeCl3-K3[Fe(CN)6]溶液由0.1mol/L的FeCl3和0.1mol/L的K3[Fe(CN)6]溶液混合而成，臨用前現(xiàn)配。用來(lái)檢測(cè)酚類。?25％SbCl3氯仿溶液,用來(lái)檢出甾族化合物。

2.影響Rf的因素顯色后可以根據(jù)各個(gè)斑點(diǎn)在薄層上的位置計(jì)算出Rf,然后根據(jù)Rf及顯色情況進(jìn)行定性分第67頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月析，但影響Rf的因素很多，Rf的重現(xiàn)性很差，影響Rf的因素有：對(duì)于吸附薄層層析（1）吸附劑的種類，性質(zhì)和質(zhì)量。即使同一種吸附劑，但不同廠家，甚至同一廠家的不同批號(hào)的產(chǎn)品性質(zhì)不同。（2）吸附劑的活度吸附劑在保存過(guò)程中會(huì)吸附水分改變活度，鋪層、點(diǎn)樣過(guò)程中空氣中的水分也會(huì)改變吸附劑的活度。第68頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月（3）展開劑的種類、組成和質(zhì)量。含有水分等強(qiáng)極性的雜質(zhì)時(shí)，嚴(yán)重影響Rf

。（4）層析缸的大小、形狀和飽和程度。（5）展開方式：上行、下行、或徑向展開。（6）點(diǎn)樣量過(guò)多斑點(diǎn)分離不清，Rf變大。（7）溫度的影響溫度的變化將影響到展開劑的揮發(fā)性,影響展開劑的組成,于是影響Rf。第69頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

（8）大量雜質(zhì)存在時(shí),會(huì)影響某些組分的Rf。對(duì)于分配層析，除了上面的(1)和(2)不影響Rf外，其它各種因素都影響，除此之外還有：

(1)載體上涂布的固定相的種類和數(shù)量

(2)層析時(shí)的溫度除影響展開劑的揮發(fā)性外，還影響各個(gè)組分在固定相和流動(dòng)相的分配系數(shù)，因而溫度顯著影響Rf值。第70頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

因此，文獻(xiàn)上查得的某種組分在一系列條件下的Rf只能供參考，不能作為定性分析的依據(jù)，但根據(jù)文獻(xiàn)的Rf值，能夠看出一系列化合物在薄層上的相對(duì)位置及分離難以程度，從而判斷這個(gè)斑點(diǎn)可能是哪一個(gè)組分，然后用已知組成的標(biāo)準(zhǔn)試劑，在同一薄層上采用多種展出劑進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，以鑒定某種成分的存在。第71頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月六薄層層析的定量測(cè)定層析展開后進(jìn)行定量測(cè)定，可以有以下幾種方法

1.目視比較半定量法將試液與一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液并排點(diǎn)在同一薄層上，層析展開后比較各斑點(diǎn)的大小及顏色的深淺，可借以估計(jì)某種組分的大概含量。第72頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月這是一種半定量方法，方法簡(jiǎn)單，適應(yīng)于作為試樣中雜質(zhì)含量的限度檢驗(yàn)，例如要檢查藥物中的某一雜質(zhì)，先試驗(yàn)在所用層析條件下,該雜質(zhì)的檢出限量，如確定最低檢出限量為0.5μg，若規(guī)定藥物中雜質(zhì)最高允許限量為1％，則在點(diǎn)樣50μg后進(jìn)行層析后，不得出現(xiàn)該雜質(zhì)斑。第73頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.測(cè)定斑點(diǎn)面積進(jìn)行定量測(cè)定層析展開后薄層上班點(diǎn)的面積和含量之間存在著一定的關(guān)系，因此測(cè)定斑點(diǎn)面積，可進(jìn)行定量測(cè)定，關(guān)于斑點(diǎn)面積和含量的關(guān)系曾有不少報(bào)道，由于試樣的種類和層析條件不同所得結(jié)論也不相同。歸納起來(lái)，含量ω和斑點(diǎn)面積之間可以有如下幾種不同的線性關(guān)系。第74頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月lgω~A成線性關(guān)系

lgω~成線性關(guān)系

lgω~lgA成線性關(guān)系究竟所測(cè)試樣適應(yīng)于哪一種線性關(guān)系，需要經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確定。測(cè)定斑點(diǎn)面積,可用面積測(cè)定儀,也可以使用透明紙將斑點(diǎn)大小描繪下來(lái),再將透明紙印在坐標(biāo)紙上,數(shù)出斑點(diǎn)的面積;也可以將描繪出的斑點(diǎn)再轉(zhuǎn)印到質(zhì)地均勻的較厚的紙上,第75頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月然后剪下稱重，以質(zhì)量代表面積，等等。由于面積一般在15－150mm2之間，測(cè)定時(shí)可能引入一定的誤差。

3.從薄層上將被測(cè)組分洗脫下來(lái)進(jìn)行定量測(cè)定這是目前最常用的定量方法，這種方法是先將被測(cè)組分的斑點(diǎn)位置確定，將斑點(diǎn)連同吸附劑一起取下，用溶劑將被測(cè)組分洗脫下來(lái)，然后進(jìn)行定量測(cè)定。這種方法的關(guān)鍵第76頁(yè)，課件共85頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月是將被測(cè)組分從薄層上定量洗脫下來(lái)，如能定量洗脫下來(lái)，可獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，這種方法的誤差一般在1－5％之間。4.利用薄層色譜掃描儀進(jìn)行定量測(cè)定在薄層展開后，利用薄層色譜掃描儀進(jìn)行定量測(cè)定，但這種儀器價(jià)格高，操作復(fù)雜，目前尚不能普及，因此不再介紹。第77頁(yè)，課件