巴氏染色-課件

巴氏染色巴氏染色巴氏染色是人體和動物脫落細(xì)胞學(xué)最常用的染色方法之一，廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及女性生殖系統(tǒng)等脫落細(xì)胞學(xué)的診斷及微生物感染的鑒定等領(lǐng)域，特別在宮頸脫落細(xì)胞學(xué)診斷方面更具有獨到之處。巴氏染色的優(yōu)點1、顏色鮮艷多彩2、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰3、胞質(zhì)顆粒分明4、透明度好等巴氏染色的不足1、配置過程復(fù)雜2、染色步驟繁瑣3、染液質(zhì)量不穩(wěn)定等（影響染色的主要原因）巴氏染色的組成蘇木素桔黃GEA50（EA36）等EA50簡介EA50的組成：伊紅，亮綠，磷鎢酸影響EA50的主要因素：EA染液的PH值巴氏染液原理蛋白質(zhì)所帶正負(fù)電荷的多少是隨染液的PH值而改變，在偏堿環(huán)境中蛋白質(zhì)的羧基游離增多（帶負(fù)電），在偏堿環(huán)境中氨基游離增多（帶正電）。氨基酸結(jié)構(gòu)通式氨基酸三維結(jié)構(gòu)巴氏染液原理蘇木素染色原理：蘇木素是堿性染料，能與細(xì)胞核內(nèi)的主要化學(xué)成分脫氧核糖核酸結(jié)合而呈紫藍(lán)色。蘇木素結(jié)構(gòu)墨水樹巴氏染液原理桔黃G：是一種小分子染料，能夠很快地作用于胞漿。作用：使宮頸、陰道上皮中非正常角化細(xì)胞和角化型鱗癌細(xì)胞的胞漿呈鮮艷的橘黃色。桔黃G巴氏染液原理伊紅、亮綠：屬于酸性染料，其發(fā)色團(tuán)為負(fù)離子，發(fā)色團(tuán)可與蛋白質(zhì)中帶正電荷的氨基結(jié)合，而使胞漿顯藍(lán)色、綠色或紅色。巴氏染液原理伊紅染料作用于成熟鱗狀細(xì)胞的胞漿、核仁，染色結(jié)果呈粉紅色。亮綠染料作用于代謝活躍的細(xì)胞，如鱗狀上皮副基底層和中層細(xì)胞、柱狀上皮細(xì)胞，染色結(jié)果呈綠色或藍(lán)綠色。伊紅結(jié)構(gòu)式巴氏染液原理磷鎢酸：酸性質(zhì)子的位置不同，酸性強(qiáng)度也不同，其中位于橋氧的酸性質(zhì)子具有超強(qiáng)酸性，其酸性甚至超過濃硫酸。作用：1、作為媒染劑

2、作為弱酸緩沖劑磷鎢酸結(jié)構(gòu)式巴氏染液的影響因素---PH較高PH值：細(xì)胞質(zhì)紅染減少，綠染增多較低PH值：細(xì)胞質(zhì)紅染增多，綠染減少巴氏染液的存放染液保存在陰涼干燥的地方，避免陽光直射。陽光或過高的溫度不僅造成染料過早失效，還會引起染液PH值降低。經(jīng)典巴氏染色結(jié)果胞核染為深藍(lán)色；鱗狀上皮底層、中層及表層角化前細(xì)胞胞質(zhì)染綠色，表層不全角化細(xì)胞胞質(zhì)染粉紅色，完全角化細(xì)胞胞質(zhì)呈桔黃色；細(xì)菌：灰色；滴蟲：淡藍(lán)灰色；黏液：淡藍(lán)色或粉紅色；中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、吞噬細(xì)胞胞質(zhì)均為藍(lán)色；紅細(xì)胞染粉紅色；高分化鱗癌細(xì)胞可染成粉紅色或桔黃色；腺癌胞質(zhì)呈灰藍(lán)色。簡易巴氏染色步驟將剛離心好的TCT玻片放入95%的酒精15min以上（此步驟為濕固定，TCT玻片不能用吹風(fēng)機(jī)吹干）70%酒精15s50%酒精15s自來水水洗蘇木素染色1%鹽酸分化0.5%氨水藍(lán)化自來水洗0.2%磷鎢酸水溶液1Min簡易EA工作液5min95%酒精清洗100%酒精清洗吹干，封片簡易巴氏染色簡易EA染色液的配置：亮綠S.F：0.72g水溶性伊紅：1.08g蒸餾水：600ml三者混合搖勻，讓兩種燃料充分溶解0.2%磷鎢酸：0.2g磷鎢酸粉末100ml蒸餾水簡易EA染色結(jié)果細(xì)胞核：呈藍(lán)色基底層、中層、表層角化前細(xì)胞質(zhì)：藍(lán)綠色表層細(xì)胞質(zhì)：紅色挖空細(xì)胞辨認(rèn)清晰念珠細(xì)菌：紫紅色滴蟲細(xì)胞質(zhì)：淺綠色、細(xì)胞核深藍(lán)色陰道桿菌：紫藍(lán)色。簡易巴氏染色注意事項固定：用95％酒精固定液固定的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本一定使用濕固定法。制片制備完后，趁標(biāo)本新鮮而又濕潤時，立即放入盛有95％酒精的固定缸內(nèi)。制片在固定液內(nèi)至少保持15-30min。濕固定的重要性：標(biāo)本在新鮮時及時固定是保證染色效果的重要因素。如蘇木素對細(xì)胞核的染色，巴氏染色中胞漿的特殊著色作用，均可因標(biāo)本干燥后固定而大受影響。簡易巴氏染色注意事項磷鎢酸水溶液越新鮮或作用時間越長，則胞質(zhì)藍(lán)綠色調(diào)越強(qiáng)，當(dāng)作用太強(qiáng)時分色效果差，因此，本法的磷鎢酸水溶液的作用時間要靈活掌握。簡易巴氏染色使用期限0.2%的磷鎢酸水溶液在染250張TCT后更換。每600mlEA可染8000張TCT片。染色不佳常見原因及解決方法1、細(xì)胞核著色不佳（1）細(xì)胞核著色過淺：

1）鹽酸分化時間過長或蘇木素染液時間過長。需要縮短分化時間或延長堿化時間；每日加入少量新鮮蘇木素染液或重新配制蘇木素液。2）在固定之前制片干燥。所以對巴氏染色的制片需要嚴(yán)格遵守濕固定的原則。3）自來水的PH值偏酸性。使用堿性溶液。（2）細(xì)胞核著色過深：

1）鹽酸溶液濃度不夠。適當(dāng)加入幾滴鹽酸以增加濃度。2）制片用高于95％以上濃度的酒精固定后可以出現(xiàn)染色過深。應(yīng)用95％酒精固定。染色不佳常見原因及解決方法2、細(xì)胞漿著色不佳（1）如果全片內(nèi)胞漿都淡染，則需要延長染色時間或更換新液。（2）如果胞漿不分色，均為淺紅色。制片在固定前干燥或制片被有大量球菌樣細(xì)菌影響胞漿染色。此情況可以適當(dāng)增加染色時間能夠部分糾正不分色狀況。（3）胞漿染成灰色或紫色，是由于蘇木素染色時間過長或鹽酸分化不佳。經(jīng)過褪色后重新蘇木素可以糾正。（4）由于標(biāo)本的不同，同樣配方的EA染液可造成偏藍(lán)、偏綠和偏紅，對不同的標(biāo)本應(yīng)該使用不同的EA染液。一般認(rèn)為，EA36和EA50用于婦科標(biāo)本，而EA65或改良EA用于非婦科標(biāo)本。（5）胞漿不分色的另一重要原因是由于EA染液的PH值不恰當(dāng)所致。如染色為紅色，可以加少許磷鎢酸溶液糾正；如染色均為藍(lán)色或綠色，可以加少許飽和碳酸鋰