沉淀法生物工程下游技術(shù)-課件

沉淀法生物工程下游技術(shù)沉淀法的目的:通過沉淀達(dá)到濃縮的目的,從而降低了后續(xù)的生產(chǎn)費(fèi)用與簡化了后續(xù)的生產(chǎn)工藝;沉淀方法可有選擇地沉淀所需成分或有選擇地沉淀雜質(zhì),起到初步分離的作用;將蛋白質(zhì)由液態(tài)變成固態(tài),幸免了蛋白質(zhì)的降解,提高了其穩(wěn)定性;關(guān)于小分子生化物質(zhì)常采納等電點(diǎn)沉淀或形成復(fù)鹽沉淀。

如抗生素生產(chǎn)中,四環(huán)素可用等電點(diǎn)或尿素復(fù)鹽沉淀法,鏈霉素與苯甲胺縮合形成希夫堿沉淀,并在酸性條件下分解以制得成品。關(guān)于大分子生化物質(zhì)常采納鹽析、有機(jī)溶劑、等電點(diǎn)及親與沉淀方法。沉淀法的應(yīng)用沉淀法的分類依照所加入的沉淀劑的不同,沉淀法能夠分為:(1)鹽析法;(2)等電點(diǎn)沉淀法;(3)有機(jī)溶劑沉淀法;(4)親與沉淀法;(4)非離子型聚合物沉淀法;(5)聚電解質(zhì)沉淀法;(6)復(fù)合鹽沉淀法等;(7)選擇性沉淀法。蛋白質(zhì)的溶解特性在水溶液中,多肽鏈中的疏水性氨基酸殘基具有向內(nèi)部折疊的趨勢,即便如此,一般仍有部分疏水性氨基酸殘基暴露在外表面,形成疏水區(qū)。親水性氨基酸殘基基本分布在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的外表面。蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì),因此,蛋白質(zhì)表面由不均勻分布的荷電基團(tuán)形成荷電區(qū)、親水區(qū)與疏水區(qū)構(gòu)成。蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域與荷電區(qū)域防止蛋白質(zhì)凝聚沉淀的屏障⑴蛋白質(zhì)周圍的水化層(hydrationshell),⑵蛋白質(zhì)分子間靜電排斥作用。蛋白質(zhì)水化層的厚度與δ電位與溶液性質(zhì)緊密相關(guān),如溫度、pH值、介電常數(shù)與離子強(qiáng)度。鹽析法當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)估計(jì)出現(xiàn)以下兩種情況:(1)“鹽溶”現(xiàn)象(salt-in)—低鹽濃度下,增加蛋白質(zhì)分子間靜電斥力,隨著中性鹽離子強(qiáng)度的增加,蛋白質(zhì)溶解度增大。(2)“鹽析”現(xiàn)象(salt-out)—高鹽濃度下,中與電荷、破壞水化膜,蛋白質(zhì)溶解度隨之下降。

鹽析法原理(1)破壞水化膜,分子間易碰撞聚集(2)破壞水化膜,暴露出疏水區(qū)域(3)中與電荷,減少靜電斥力㏒S=β-ＫsＩS—蛋白質(zhì)的溶解度,g/L;I－離子強(qiáng)度,

I=1/2∑mizi2

mi—離子i的摩爾濃度;Zi—所帶電荷β—常數(shù),圖中截距Ks—鹽析常數(shù),圖中直線斜率Cohn經(jīng)驗(yàn)式

蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度的關(guān)系鹽析操作1)加入固體鹽法用于要求飽與度較高而不增大溶液體積的情況,工業(yè)上常采納這種方法。2)加入飽與溶液法用于要求飽與度不高而原來溶液體積不大的情況。3)透析平衡法先將鹽析的樣品裝于透析袋中,然后浸入飽與硫酸銨中進(jìn)行透析,袋內(nèi)飽與度逐漸提高,達(dá)到設(shè)定濃度后,目的蛋白析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于硫酸銨濃度變化有連續(xù)性同時(shí)緩慢,鹽析效果好,故多用于結(jié)晶。鹽析作用要強(qiáng)需有較大的溶解度鹽溶液密度不高鹽析用鹽必須是惰性的來源豐富、經(jīng)濟(jì)例如:鹽析中常用的鹽:硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉硫酸銨是最常用的蛋白質(zhì)鹽析沉淀劑。鹽析用鹽的選擇一般的規(guī)律為:半徑小的高價(jià)陰離子的鹽析作用較強(qiáng)。例如:陰離子鹽析效果:檸檬酸＞PO43-＞SO42-

＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-陽離子鹽析效果:NH4+＞K+＞Na+＞Mg2+陰離子對蛋白質(zhì)溶解度的影響大于陽離子。1、鹽濃度)鹽濃度在進(jìn)行分離的時(shí)候,一般從低離子強(qiáng)度到高離子強(qiáng)度順次進(jìn)行。

每一組分被鹽析出來后,經(jīng)過過濾或冷凍離心收集,再在溶液中逐漸提高中性鹽的飽與度,使另一種蛋白質(zhì)組分鹽析出來。影響鹽析效果的因素鹽析用鹽量的確定-飽與度:目標(biāo)蛋白質(zhì)在鹽析沉淀操作之前,所需的中性鹽的濃度可通過實(shí)驗(yàn)確定。對多數(shù)蛋白質(zhì),當(dāng)達(dá)到85%飽與度時(shí),溶解度都小于0、lmg／L,通常為兼顧收率與純度,飽與度的操作范圍在40%-60%之間。分段鹽析(fractionalsaltingout)硫酸銨的飽與度/%沉淀的蛋白質(zhì)硫酸銨的飽與度/%沉淀的蛋白質(zhì)20纖維蛋白質(zhì)>50白蛋白28～33優(yōu)球蛋白80肌紅蛋白33～50擬球蛋白可在較低飽與度下先除去雜蛋白,然后在較高的飽與度下,沉淀目標(biāo)蛋白質(zhì),稱為分段鹽析。分段鹽析時(shí),可選擇稀一些的蛋白質(zhì)溶液,使共沉淀作用減至最低限度。表1血漿蛋白的分段鹽析結(jié)果2、蛋白質(zhì)種類與濃度組成相近的蛋白質(zhì),分子量越大,沉淀所需鹽的量越少;蛋白質(zhì)分子不對稱性越大,也越易沉淀。不同濃度的同種蛋白質(zhì)溶液要產(chǎn)生沉淀所要求的臨界鹽濃度不同。蛋白質(zhì)濃度大時(shí),用鹽少,沉淀作用強(qiáng),蛋白質(zhì)溶解損失小。

一般常將蛋白質(zhì)的含量控制在2～3%為宜。影響鹽析效果的因素對起始濃度為30g/L的碳氧肌紅蛋白溶液,目標(biāo)蛋白在硫酸銨飽與度為58-65％之間沉淀出來;當(dāng)稀釋10倍時(shí),飽與度達(dá)到66%時(shí)才開始沉淀,而相應(yīng)的沉淀范圍為66-73%飽與度。硫酸銨鹽析過程

目標(biāo)蛋白的最適飽與度是多少？204060800100總蛋白目標(biāo)蛋白質(zhì)上清液蛋白濃度3、pH值為提高鹽析效率,多將溶液pH值調(diào)到目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)處。在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的,需依照實(shí)際情況調(diào)整溶液pH值,以達(dá)到最好的鹽析效果。

影響鹽析效果的因素在進(jìn)行鹽折時(shí),必須控制pH圖中直線都相互平行pH值鹽析影響因素:4、溫度的影響在高鹽濃度下,大部分蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下,鹽析可在室溫下進(jìn)行,只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進(jìn)行。鹽析法特點(diǎn)成本低,操作簡單、安全;在中性溫與的環(huán)境中,可不能引起蛋白質(zhì)變性;鹽析后要透析或超濾去鹽;只是作為初步的分離純化,還需要結(jié)合其它的純化方法。等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀:在低離子強(qiáng)度下,調(diào)pH至等電點(diǎn),使蛋白質(zhì)所帶凈電荷為零,降低了靜電斥力,而疏水力能使分子間相互吸引,形成沉淀。

pH=pI等電點(diǎn)沉淀法注意事項(xiàng)本法適用于疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì);例如:酪蛋白在等電點(diǎn)時(shí)能形成粗大的凝聚物。但對一些親水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)。如明膠,則在低離子強(qiáng)度的溶液中,調(diào)pH在等電點(diǎn)并不產(chǎn)生沉淀。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)易受鹽離子的影響發(fā)生變化;

自然界中,蛋白質(zhì)較易結(jié)合陰離子,使等電點(diǎn)向酸側(cè)移動。

低離子強(qiáng)度下,pH約等于等電點(diǎn)。在調(diào)節(jié)等電點(diǎn)時(shí),要注意防止酶的失活或蛋白變性。一般使用可用乙酸、碳酸等弱酸與碳酸鈉等弱堿。蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近鹽溶作用明顯,必須控制溶液較高的離子強(qiáng)度。等電點(diǎn)沉淀法往往不能獲得高的回收率,通常與其他沉淀方法結(jié)合使用;定義:在含有溶質(zhì)的水溶液中加入一定量親水的有機(jī)溶劑,降低溶質(zhì)的溶解度,使其沉淀析出。優(yōu)點(diǎn):1)分辨能力比鹽析法高;2)沉淀不用脫鹽;3)離心收集較為容易;4)溶劑沸點(diǎn)較低,除去回收方便。缺點(diǎn):1)容易引起變性失活;2)操作要求在低溫下進(jìn)行;3)有機(jī)溶劑易揮發(fā),需有防護(hù)。

有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法機(jī)理有機(jī)溶劑沉淀法原理

A降低溶劑介電常數(shù)B破壞水化膜C相反力表2一些有機(jī)溶劑的介電常數(shù)

溶劑介電常數(shù)溶劑介電常數(shù)水802、5M尿素8420%乙醇705M尿素9140%乙醇60丙酮2260%乙醇48甲醇33100%乙醇24丙醇232、5M甘氨酸137常用的有機(jī)溶劑水溶性要好介電常數(shù)要小致變性作用要小毒性要小、揮發(fā)性適中容易獲取常用的有機(jī)溶劑:乙醇、甲醇與丙酮

1、溫度

使用有機(jī)溶劑沉淀時(shí),操作必須在低溫下進(jìn)行,有機(jī)溶劑要預(yù)冷,并緩緩加入伴隨不斷攪拌,一是防止溶液局部升溫,二是為了防止局部過濃引起變性作用與分辨率下降。溫度還會影響有機(jī)溶劑對蛋白質(zhì)的沉淀能力。

大多數(shù)蛋白質(zhì)在乙醇-水體系中溶解度隨溫度降低而減少,低溫對提高收率也是有利的。

有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素2、pH值:許多蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近有較好的沉淀效果。

3、樣品濃度:樣品較稀時(shí),將增加有機(jī)溶劑投入量,降低了樣品的回收率;樣品太濃,會增加共沉作用。一般認(rèn)為蛋白質(zhì)的初濃度以0、5～2％為好,粘多糖則以1～2％較合適。

4、中性鹽濃度:較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用,減少蛋白質(zhì)變性。

一般中性鹽濃度以0、01～0、05mol/L為好,常用的中性鹽為氯化鈉等。有機(jī)溶劑沉淀法的影響因素例:

調(diào)pH4、2上清液胰島素粗品溶液

30%丙酮沉淀(雜蛋白)上清液調(diào)pH6、0上清液Zn2+

胰島素鋅鹽↓

舉例:固體發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶的提取工藝研究

α-淀粉酶(米曲霉)菌體+水過濾水抽提清液

加乙醇(70%)攪拌α-淀粉酶↓

*pH影響

收率酶活

6、5pH

*適宜的pH5、6~6、0

*溫度影響

酶活

收率

1020T℃

*適宜的溫度10~20℃

水溶性非離子型聚合物機(jī)理:與有機(jī)溶劑相似,破壞蛋白質(zhì)的水化膜。常用非離子性聚合物:聚乙二醇(PEG):是一種水溶性的高分子聚合物,分子量4,000以上的PEG能夠用來沉淀蛋白質(zhì)。

還有葡聚糖、右旋糖酐硫酸酯等。優(yōu)缺點(diǎn):1、可在室溫下進(jìn)行2、沉淀顆粒大,易于收集3、能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)4、PEG難去除用聚乙二醇等非離子性聚合物一般用來沉淀核酸(如質(zhì)粒)與酶。多聚電解質(zhì)沉淀

機(jī)理:架橋與靜電,與絮凝劑類似。離子型多糖聚合物,酸性多糖、羧甲基纖維素、海藻酸鈉。合成的離子聚合物:聚丙烯酸聚苯乙烯季胺鹽聚甲基丙烯酸聚乙烯亞胺此類沉析劑有以下三種:(1)高價(jià)金屬鹽:Cu2+,Ag2+,Zn2+,Ca2+

與酸性基團(tuán)結(jié)合;(2)苦味酸鹽、單寧酸鹽、鞣質(zhì)等,與堿性基 團(tuán)結(jié)合;(3)無機(jī)復(fù)合鹽:磷鎢酸鹽、磷鉬酸鹽等優(yōu)點(diǎn):以上鹽類復(fù)合物的溶解度特別低,極容易沉淀析出。缺點(diǎn):容易導(dǎo)致活性蛋白的不可逆變性,需采納較溫與的條件。成鹽類復(fù)合物沉淀１)金屬離子沉淀金屬離子的沉淀作用是由于它們能與蛋白質(zhì)分子中的特別部位(如羧基、氨基、咪唑基與巰基)起反應(yīng)造成的。

例如Zn2+易與組氨酸殘基中咪唑基結(jié)合,從而降低蛋白質(zhì)的溶解度。①能與羧基、胺基等含氮化合物以及含氮雜環(huán)化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子,如:Mn2+、Fe2+

、Ｃo2+、Ni2+

、Ｃu2+、Zn2+、Cd2+;②能與羧酸結(jié)合而不與含氮化合物結(jié)合的一些金屬離子,如:Ca2+

、Ba2+、Mg2+、Pb2+;③能巰基化合物強(qiáng)烈結(jié)合的一些金屬離子,如:Ｈg2+

、Ag2+

、Pb2+。選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法:選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀下來,而與目的物分開。分離核酸沉淀劑:酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉等目的:使核酸與蛋白質(zhì)分離,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸則存在于水溶液中。例如:在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇,振蕩一段時(shí)間、使蛋白質(zhì)在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去,核酸仍然留在水溶液中。在對氨基水楊酸等陰離子化合物存在下,用苯酚-水溶液提取核酸,而蛋白質(zhì)在苯酚層中形成沉淀而被除去。分離多糖沉淀劑:CTAB(十六烷基三甲基季銨鹽溴化物)CPC(十六烷基氯化吡啶)原理:季銨基團(tuán)上的陽離子與多糖上的陰離子形成形成季銨絡(luò)合物,降低離子強(qiáng)度,絡(luò)合物析出,但當(dāng)離子強(qiáng)度增加到一定范圍時(shí),絡(luò)合物解離,最后溶解。沉淀劑:三氯乙酸例如用2、5%三氯乙酸處理胰蛋白酶、抑肽酶或細(xì)胞色素c粗提取液,均可除去大量雜蛋白,而對所提取的酶活力沒有影響。但使用前,必須對酶的酸堿穩(wěn)定性有足夠了解,使用時(shí)一般應(yīng)注意環(huán)境條件溫與(如低溫段時(shí)間)分離蛋白質(zhì)各種沉淀方法應(yīng)用范圍鹽析法:多用于各種蛋白質(zhì)與酶的分離純化。有機(jī)溶劑沉淀法:多用于生物小分子、多糖及核酸產(chǎn)品的分離純化,有時(shí)也用于蛋白質(zhì)沉淀。等電點(diǎn)沉淀法:用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀。但單獨(dú)應(yīng)用較少,多與其它方法結(jié)合使用。非離子聚合物沉淀法:用于分離生物大分子。生成鹽類復(fù)合物沉淀:多用于小分子物質(zhì)的沉淀。選擇性沉淀:多用于除去某些不耐熱的與在一定條件下易變性的雜蛋白。親與沉淀

affinityprecipitation

原理:是一種將生物專一性識別與沉淀分離相結(jié)合的分離純化技術(shù)。

可逆性溶解聚合物在溶液