基因組測序的原理與方法課件

大規(guī)?；蚪M測序的

原理與方法1ppt課件.

元素周期表的發(fā)現(xiàn)奠定了二十世紀物理、化學研究和發(fā)展的基礎(chǔ)元素周期表“基因組序列圖”將奠定二十一世紀生命科學研究和生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)！

“基因組”----生命科學的“元素周期表”人體解剖圖奠定了現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展的基礎(chǔ)2ppt課件.基因組學的基礎(chǔ)理論研究基因組學是要揭示下述四種整合體系的相互關(guān)系:基因組作為信息載體

（堿基對、重復序列的整體守恒與局部不平衡的關(guān)系）基因組作為遺傳物質(zhì)的整合體

(基因作為功能和結(jié)構(gòu)單位與遺傳學機制的關(guān)系)基因組作為生物化學分子的整合體

(基因產(chǎn)物作為功能分子與分子、細胞機制的關(guān)系）物種進化的整合體

(物種在地理與大氣環(huán)境中的自然選擇）3ppt課件.

基因組學是一個大學科“界門綱目科屬種”，地球上現(xiàn)存物種近億，所有生生滅滅的生物，無一例外，都有個基因組?；蚪M作為信息載體，它所儲存的信息是最基本的生物學信息之一；既是生命本質(zhì)研究的出發(fā)點之一，又是生物信息的歸宿?；蚪M學研究包括對基因產(chǎn)物（轉(zhuǎn)錄子組和蛋白質(zhì)組）的系統(tǒng)生物學研究?；蚨鄳B(tài)性的規(guī)?；芯烤褪腔蚪M多態(tài)性的研究?；蚪M學的研究必然要上升到細胞機制、分子機制和系統(tǒng)生物學的水平?；蚪M的起源與進化和物種的起源與進化一樣是一個新的科學領(lǐng)域?；蚪M信息正在以天文數(shù)字計算，規(guī)?；胤e累，它的深入研究必將形成一個嶄新的學科。4ppt課件.

基因組學是一門大科學基因組的信息是用來發(fā)現(xiàn)和解釋具有普遍意義的生命現(xiàn)象和它們的變化、內(nèi)在規(guī)律和相互關(guān)系?；蚪M的信息含量高?；蚪M學的研究又在于基因組間的比較?；蚪M學的復雜性必然導致多學科的引進和介入（各生物學科、醫(yī)學、藥學、計算機科學、化學、數(shù)學、物理學、電子工程學、考古學等）?；蚪M學研究的手段和技術(shù)已經(jīng)走在生命科學研究的最前沿。基因組信息來自于高效率和規(guī)?；a(chǎn)生的實驗數(shù)據(jù)。人類基因組計劃證明了基因組研究的迫切性和可行性。5ppt課件.基因組與生命之謎基因組的產(chǎn)生與進化?；蚪MDNA組分的變化、GC百分比、嘌呤：嘧啶守恒。遺傳密碼的發(fā)生、發(fā)展和進化。內(nèi)含子（尤其是大于100，000核苷酸的大內(nèi)含子）剪出后的運輸和降解。最小內(nèi)含子的生物學意義。動物基因組與植物基因組在基因分布上的共性和個性。物種衍變過程中基因組水平的變化?；蚪M大小變化與遺傳、分子、細胞機制的關(guān)系?！癑UNKDNA”的發(fā)生、分類、進化與功能。6ppt課件.

大規(guī)?；蚪M測序漸入佳境三十億三年內(nèi)完成：繼酵母、線蟲、果蠅、擬南芥后，是人、斑馬魚、水稻和小鼠的基因組。三百億計劃已在執(zhí)行：大鼠、豬、黑猩猩、狒狒、雞、牛、小麥、玉米、大麥、大豆、棉花、各種人畜寄生蟲和幾百種人、動物和植物的病原微生物。三千億勢在必行。將涉及家畜、家禽、樹木、海洋生物、實驗模式生物等所有代表物種。7ppt課件.

大規(guī)模和高速度的重要性測定一個哺乳動物基因組30億堿基對相當于6千萬測序道（每道500核苷酸）相當于300臺毛細管電泳儀全負荷運行一年測定一個細菌基因組5百萬堿基對相當于十萬測序道相當于180臺機器/天知識經(jīng)濟的特點知識產(chǎn)權(quán)為出發(fā)點知識產(chǎn)權(quán)的占有者對后來者的制約8ppt課件.基因組學與計算機科學的接軌“海量”（>1010)基因組信息的收集、管理和分析科學文獻、組織與發(fā)育的三維解剖圖像、生物分子的分類和相關(guān)性等的高速檢索（>1014)多維生物分子結(jié)構(gòu)的運算和預測（>1022)生物分子之間的相互作用(信號傳導、神經(jīng)傳導、大腦功能模擬、細胞機制模擬等)（>1030)計算生物學和系統(tǒng)生物學研究的未來(>1050)9ppt課件.世界大型基因組研究中心美國：1)NationalHumanGenomeResearchInstitutioninNIH 2)GenomeCenteratWhiteHead/MIT 3)WashingtonUniversityGenomeCenter 4)JointGenomeInstitutionatDOE 5)GenomeCenteratBaylorMedicalCollage

英國：Sanger

Center日本：RIKEN中國：華大基因研究中心（北京、杭州）

國家人類基因組中心（北京、上海）

10ppt課件.大規(guī)?；蚪M測序的幾個支撐技術(shù)

Sanger雙脫氧末端終止法

PCR技術(shù)

DNA自動測序儀的發(fā)展生物信息學分析軟硬件設施11ppt課件.“雙脫氧末端終止”的含義12ppt課件.

PCR（聚合酶鏈式反應）原理反應所需物質(zhì)：DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP、緩沖液每個循環(huán)包括：變性（90℃）、退火（54℃）、延伸（72℃）13ppt課件.Sanger雙脫氧末端終止法測序原理14ppt課件.DNA自動測序儀的發(fā)展

自動熒光毛細管凝膠電泳測序儀代表：安瑪西亞公司MegaBACE1000

96個電泳讀長高達500-600bp

日分析能力達1000個樣品自動熒光垂直板凝膠電泳測序儀

代表：ABI公司377型垂直板自動測序儀

96個泳道讀長高達700-800bp

日分析能力達300個樣品

電泳，看誰跑得快熒光檢測探頭

短片段先檢測到長片段后檢測到15ppt課件.大規(guī)?；蚪M測序的兩種策略逐步克隆法（ClonebyClone）全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)16ppt課件.………ATGCCGTAGGCCTAGCTAGGCCTAGCTCGGA……………ATGCCGTAGGCCTAGCTCGGA……基因組DNABAC文庫根據(jù)物理圖譜正確定位的BAC或contig用于霰彈法測序的候選克隆用于霰彈法測序的亞克隆測序并組裝完整的基因組序列逐步克隆法（ClonebyClone）

全基因組霰彈法（WholeGenomeShot-gun)基因組DNA

霰彈法克隆測序并進行全基因組序列組裝完整的基因組序列17ppt課件.

兩種大規(guī)模基因組測序策略的比較

項目

策略全基因組霰彈法逐步克隆法

遺傳背景不需要需要（需構(gòu)建精確的物理圖譜）速度快慢費用低高計算機性能高（以全基因組為單位進行拼接）低（以BAC為單位進行拼接）適用范圍工作框架圖精細圖代表測序物種果蠅、水稻人、線蟲18ppt課件.BACbyBACWholeGenomeShotgun…thesequencingofthehumangenomeislikelytobetheonlylargesequencingprojectcarriedtocompletionbythemethodsdescribedinthisissue.

19ppt課件.“WorkingDraft”(90%;4X)FinishedGenome(99.99%;8X)Gap1Gap2Chromosome工作草稿（框架圖）與完成圖20ppt課件.人類基因組計劃研究的主要成果和進展表現(xiàn)在這“四張圖”遺傳圖譜又稱為連鎖圖譜（linkagemap），指基因或DNA標志在染色體上的相對位置與遺傳距離物理圖譜

以定位的DNA標記序列如STS作為路標，以DNA實際長度即bp、kb、Mb為圖距的基因組圖譜。轉(zhuǎn)錄圖譜

利用EST（expressedsequencetags

表達序列標簽）作為標記所構(gòu)建的分子遺傳圖譜序列圖譜通過基因組測序得到的，以A、T、G、C為標記單位的基因組DNA序列

21ppt課件.逐步克隆法（ClonebyClone)物理圖譜的構(gòu)建大片段克隆的篩選霰彈法測序與“工作框架圖”的構(gòu)建序列的全組裝與“完成圖”構(gòu)建22ppt課件.物理圖譜的制作

23ppt課件.物理圖譜的制作——序列標簽位點（STS）作圖

物理圖譜是以特異的DNA序列為標志所展示的染色體圖。標志之間的距離或圖距以物理距離如堿基對（basepair；bp，Kb,Mb)表示。最精細的物理圖是核苷酸順序圖，最粗略的物理圖是染色體組型圖。

STS圖譜是最基本和最為有用的染色體物理圖譜之一，STS（SequenceTaggedSite)本身是隨機地從人類基因組上選擇出來的長度在200～300bp左右的特異性短序列（每個STS在基因組中是唯一的，STS圖譜就是以STS為路標（平均每100Kb一個），將DNA克隆片段有序地定位到基因組上。STS的來源隨機基因組序列表達基因序列，如EST遺傳標記序列，如微衛(wèi)星標記有關(guān)STS的信息可在基因組數(shù)據(jù)庫GDB中找到http://gdbwww.gdb.org24ppt課件.物理圖譜構(gòu)建的步驟確定各STS序列及其在基因組中的位置大插入片段基因組文庫的構(gòu)建（BAC文庫）以特定STS為標記篩選并定位克隆含有STS的克隆在基因組中排序基因組數(shù)據(jù)庫（GDB）中至少含有24568個STS路標信息

25ppt課件.關(guān)于文庫作為載體的基本要求

能在宿主細胞中進行獨立的復制具有多克隆位點，可插入外源DNA片段有合適的篩選標記，如抗藥性大小合適，易于分離純化拷貝數(shù)多

文庫的概念

含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體載體：能攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具，常用的載體有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、細菌人工染色體等宿主：能容納外源DNA片段的生物體，常用的有大腸桿菌、酵母等26ppt課件.BAC文庫的構(gòu)建NotI、SacI脈沖場凝膠電泳得200Kb左右的大片段DNA

純化后與載體連接

電轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物導入大腸桿菌感受態(tài)細胞插有外源DNA片段的BAC載體在含有氯霉素的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)每一個菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆27ppt課件.BAC克隆的篩選“STS-PCR反應池”方案篩選種子克隆特定的STS標記

相互間具有重疊片段的BAC克隆根據(jù)STS信息組裝成重疊群

，并定位于基因組上Contig每一個菌落為帶有相同外源DNA片段的單克隆28ppt課件.29ppt課件.共48個每組8個每8個96孔板組成1個superpool，384個96孔板組成48個superpools

48superpools30ppt課件.

Columnpools

Rowpools

123456789101112第八板第二板Platepools第一板

platepools，rowpools，columnpools的構(gòu)成

31ppt課件.“STS-PCR反應池”方案（PoolingProtocol）

1234567891011

12超級池（8個96孔板，共768個克隆）板池（96個克隆）行池（12個克?。┝谐兀?個克隆）大大減少篩選的工作量，降低成本，所得篩選結(jié)果準確可靠

28VS76832ppt課件.sheetofsuperpools,platepools,rowpools,columnpools

33ppt課件.

一BACScreening前48個樣品為引物OGG1.51對superpool(sp)的篩選結(jié)果后48個樣品為引物OGG1.52對superpool(sp)的篩選結(jié)果

34ppt課件.引物OGG1.52對應sp#27,34,45的plate,row,columnpools的篩選結(jié)果35ppt課件.BACclone確定

(+為陽性克隆)

36ppt課件.引物OGG1.52的Colony-PCR

37ppt課件.延伸克隆的篩選

STS的密度尚未達到繪制高精度物理圖譜的要求，且在基因組中的分布不均勻，造成很多區(qū)域沒有陽性克隆覆蓋,形成空洞。因此需用指紋圖譜（FPC法）或末端序列（WalkingbyEndSequence)步移等手段對種子克隆進行延伸，形成連續(xù)克隆群。利用延伸方法篩選得到的克隆稱為延伸克隆。

Contig1Contig2重疊序列重疊序列延伸引物篩選到的延伸克隆38ppt課件.>20kb~300bpMolecularweightmarkerevery5thlaneBACclones在96深孔板中培養(yǎng)-HindIII完全酶切-1%瓊脂糖凝膠電泳

指紋圖譜法

（WalkingbyFingerprintingdatabase）

挑取靠近空洞的種子克隆，酶切構(gòu)建其指紋圖譜，在FPC數(shù)據(jù)庫中進行比對，搜索含有此克隆的重疊克隆群信息，從中確定覆蓋空洞區(qū)域的克隆，達到延伸目的。39ppt課件.末端序列步行法（WalkingbyEndSequence）

挑取靠近空洞的種子克隆進行末端測序，然后在基因組數(shù)據(jù)庫中進行比對，確定專一性的序列片段作為新的STS路標。最后設計新路標的PCR引物，按照STS—PCR“反應池”方案篩選新的克隆，達到延伸的目的?？寺?50A18序列輸入endsequencedatabase的查詢結(jié)果40ppt課件.四、CloneIdentification1、STS-PCR2、BACendsequencing3、Fingerprinting4、FISH

41ppt課件.CK2CK1CK2CK113f06267l16481o07250a15204c23340j13對15個克隆進行HindIII酶切后電泳結(jié)果

42ppt課件.43ppt課件.“工作框架圖”繪制根據(jù)序列與STSdatabase進行blastn比較結(jié)果，將克隆定位末端序的比較，判定延伸在contig外的一端序列。并可及時進行walking，篩選新的克隆

44ppt課件.霰彈法測序組裝與Finishing45ppt課件.SequenceDataDistributionVector大規(guī)模基因組測序中的信息分析BasecallingRepeatMarkORFPredictionGeneAnnotationFinishingAssembleVectorMarkPhredPhd2fastaCrossmatchPhrapConsedRepeatmaskerGlimmerBlastxBlastnClastaltRNAscanQualityControlQualCalQualDrawQualStatCOGsSwiss-port,PIR,GDB,GenBankSequencing46ppt課件.ShotgunSequencingI:RANDOMPHASEBacClone:100-200kbShearedDNA:1.0-2.0kbSequencingTemplates:RandomReads47ppt課件.ShotgunSequencingII:ASSEMBLYConsensusSequenceGap

LowBaseQualitySingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)48ppt課件.ShotgunSequencingIII:FINISHINGHighAccuracySequence:<1error/10,000bases49ppt課件.Assembly基本軟件：phrap功能：對所有的reads根據(jù)它們的序列文件和質(zhì)量文件比較各個reads之間的重疊部分

，對最有可能連接的reads進行拼接，產(chǎn)生.seq.screen.contigs和.seq.screen.singlets以及phrap.out文件。50ppt課件.Consed軟件顯示序列組裝結(jié)果界面

1、Filling“intraclonegaps”51ppt課件.

SequencedcloneBACselectedby

end-sequence113L10324K11173F11101A4167P17586C2116K5572B22544N5R-155E142006P232306M15R-149E1560K?Gapfillingbyendsequences2、Filling“interclonegaps”52ppt課件.克隆211B19組裝后的序列的錯誤率為零

53ppt課件.WGS的三個階段GenomeSurvey（GS）

1－2測序覆蓋度WorkingDraft(WD)：（90％以上的功能區(qū)域覆蓋度）

3－4測序覆蓋度GenomeCompletion(GC):(99％以上的功能區(qū)域覆蓋度) 6測序覆蓋度以上54ppt課件.Finishing軟件：consed功能：讀取phrap產(chǎn)生的<project>.ace文件，可以直觀的看到所有的contig的拼接情況，讓人可以根據(jù)情況改變拼接質(zhì)量，設計引物來彌補gap。55ppt課件.術(shù)語鳥槍法測序數(shù)據(jù)的組裝鳥槍法文庫：目標基因組一定長度隨機片段克隆的集合。正反向測序?qū)Γ簭耐粋€克隆片段兩端分別測序所得到的一對序列。.插入片段長度：克隆載體中插入的外源DNA片段長度。片段連接群(contig)：用識別互相重疊的方法對測序數(shù)據(jù)進行拼接的結(jié)果。.Scaffold:用正反向測序?qū)B接的非重疊片段連接群。LW-洞：由于沒有測序數(shù)據(jù)覆蓋而在組裝結(jié)果中留下的洞。56ppt課件.重復序列分析覆蓋度：基因組被測序數(shù)據(jù)覆蓋的次數(shù)。重復數(shù)：一段DNA序列在基因組中出現(xiàn)的次數(shù)。深度：一段DNA序列在鳥槍法測序數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)次數(shù)。例如一個轉(zhuǎn)座子在基因組中出現(xiàn)N次，測序數(shù)據(jù)集的覆蓋度為C,則這個轉(zhuǎn)座子的平均深度為NC。20-mer重復序列：任何深度超過為該數(shù)據(jù)集確定的重復序列標準的20-bpDNA片段。是數(shù)學定義的重復序列。重復序列洞：由于屏蔽重復序列而在組裝結(jié)果中留下的洞。57ppt課件.組裝結(jié)果的評價標準N50大?。喊呀M裝出的contigs或scaffolds從大到小排列，當其累計長度剛剛超過全部組裝序列總長度一半時，最后一個contig或scaffold的大小。單堿基錯誤率：與參考序列比較后發(fā)現(xiàn)的小尺度上的不同所占的比例。所謂小尺度，在這里通常指小于標準測序長度，即500bp。實際上常常只是幾個堿基。錯誤組裝的Contig：測序數(shù)據(jù)組裝中出現(xiàn)的錯誤。由定義，它涉及的片段一般大于500-bp。包括與參考序列相比，插入、刪除，以及在方向和次序上不同的片段。錯誤組裝的Scaffold：把非重疊contig連接在一起時出現(xiàn)的錯誤。包括嵌套，錯誤的方向和順序等。58ppt課件.TheFlowChartofRePS59ppt課件.重復序列的檢測與處理60ppt課件.插入片段大小引起的錯誤組裝61ppt課件.RePS2的新流程圖62ppt課件.果蠅組裝軟件（2000）特點：組裝前數(shù)據(jù)預處理；用數(shù)據(jù)庫屏蔽重復序列；采用類似BLAST的方法找出重疊部分；選擇不沖突的重疊構(gòu)建contigs，識別重復序列邊界；用正反向信息構(gòu)建scaffolds，填洞。使用情況：用于果蠅基因組組裝。63ppt課件.用于人類基因組組裝時的改進（2001）構(gòu)建contigs后，利用一個統(tǒng)計模型識別低拷貝重復序列；采用兩種方式利用已公布的人類基因組計劃數(shù)據(jù)，即

1.把人類基因組計劃數(shù)據(jù)分解成“人工reads”，進行組裝；

2.利用人類基因組計劃數(shù)據(jù)的定位對shotgun數(shù)據(jù)進行分組，然后組裝。64ppt課件.ARACHNE（2002）特點：組裝前通過多序列比對糾正測序錯誤；考慮質(zhì)量數(shù)據(jù)，對每對重疊reads打分；通過分析reads重疊情況識別重復序列的邊界，組裝的contigs避免越過邊界；識別重復序列contigs；構(gòu)建scaffolds，填補空洞。使用情況：使用數(shù)個物種，包括人21、22染色體數(shù)據(jù)進行了檢驗。65ppt課件.ThePhusionAssembler（2003）特點：輸入數(shù)據(jù)包括正反向信息，插入片段長度在2-200kb之間；組裝前先對數(shù)據(jù)進行分組，然后并行處理；使用phrap進行組裝，組裝過程中利用正反向信息對contig進行延伸或打斷；根據(jù)重疊合并contigs；利用正反向信息構(gòu)建scaffolds。使用情況：用于小鼠基因組，7.5x，2.6Gb，479scaffolds66ppt課件.基因預測軟件介紹基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡和模式識別的算法和軟件GRAIL（）GeneParser（/~eesnyder/GeneParser.html）GENEIDhttp://www1.imim.es/software/geneid/index.html基于語言學方法Genlang/genlang/genlang_home.html基于隱含馬爾可夫模型Genie/~dkulp/cgi-bin/genie）HMMgenehttp://WWW.cbs.dtudk/services/HMMgene/）GeneFinder軟件由美國華盛頓大學的ColinWilson，LaDeanaHilyer,和PhilGreen研發(fā)GENSCAN軟件由斯坦福大學數(shù)學系ChrisBurge和SamuelKarlin所研發(fā)67ppt課件.比較基因組研究“近親”的物種之間的差異非常小，有些在基因組序列水平的相似性就高達90％以上。但盡管如此，那些不足10％的序列差異卻導致了它們之間的很多本質(zhì)的變化，如種屬的差異或致病性的有無等等。因此，對它們進行比較基因組的研究可能可以為人們理解物種間差異的本質(zhì)、基因的橫向轉(zhuǎn)移在進化中的作用和特定微生物致病的機制等提供一條捷徑。例如，威斯康星基因組中心通過對大腸桿菌的致病株O157:H7株和非致病株K-12株進行基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，它們之間共有了一個約4.1Mbp的高度同源且?guī)缀蹙€性一致的“主干”基因組序列（只在復制的終止點附近出現(xiàn)了一個約422Kbp的倒置），而這個主干序列則被幾百個具有株特異性（stain-specific）的片斷序列所“切斷”,并且在O157:H7株的這些特異性的序列片斷中，他們發(fā)現(xiàn)了很多可能的毒力相關(guān)的基因和一些前噬菌體的基因等，從而為研究O157:H7株的致病性機理提供了很大的幫助.68ppt課件.大規(guī)模基因組測序平臺逐步實現(xiàn)生物資源的“信息化、產(chǎn)權(quán)化、產(chǎn)業(yè)化”的基本支持利用我國有限的、可專利的生物資源的根本保障69ppt課件.70ppt課件.測序能力的“三級跳”人類基因組計劃1%項目的finishing(1999年)中-丹合作的家豬基因組計劃(2000年)水稻工作框架圖的繪制和公布(2001年)標志著我國已掌握了國際先進的測序技術(shù)，具有相當?shù)臏y序能力。測序能力和質(zhì)量已達到國際一流水平,以獨立承擔大規(guī)模的基因組測序項目我國已經(jīng)成為繼美國之后世界上第二個具有獨立完成大規(guī)模的全基因組測序和組裝分析能力的國家71ppt課件.大規(guī)模、低成本已形成了一條世界第六、亞洲最大的基因組測序技術(shù)平臺，共有MegaBACE測序儀104臺，ABI3730測序儀2臺，ABI377測序儀11臺，滿負荷運轉(zhuǎn)日產(chǎn)可達50Mb，是一個低投入、高產(chǎn)出，高度自動化的測序平臺。72ppt課件.測序平臺的構(gòu)成

73ppt課件.

大規(guī)模測序平臺的構(gòu)成

文庫組培養(yǎng)組模板組電泳組反應組

MegaBACE

上機組數(shù)據(jù)處理組

基因組隨機文庫的構(gòu)建

測序模板的制備

測序反應與純化反應產(chǎn)物上機測序

序列數(shù)據(jù)的接收、質(zhì)量評估、組裝等

含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌培養(yǎng)檢測模板質(zhì)量與測序定量74ppt課件.文庫組各種物種DNA的提取載體的制備大片段文庫(BAC、Cosmid)的構(gòu)建霰彈法文庫(pUC18)的構(gòu)建文庫質(zhì)量的檢測轉(zhuǎn)化文庫的保存75ppt課件.霰彈法文庫與BAC文庫的區(qū)別

項目

兩種文庫BAC文庫霰彈法文庫文庫的直接用途大片段DNA在基因組上定位測序基因組片段化的方法NotI/SacI不完全消化酶切超聲波打斷插入的DNA片段長度大100～300Kb小2～3Kb載體細菌人工染色體Bac質(zhì)粒載體pUC18

76ppt課件.霰彈法文庫構(gòu)建過程

超聲：打斷基因組DNA，電泳檢測超聲效果

純化、末端補平：片段化的DNA純化，并用T4DNA聚合酶補平末端

電泳：1%瓊脂糖凝膠電泳，切下含1.6-2.0kb、2.0-2.5kb及2.5-3.0kb的DNA片段的凝膠

回收：用QIAEXIIGELExtractionKit回收試劑盒從膠中回收DNA片段

連接：用T4DNA連接酶連接DNA片段和用SmaI酶切后的pUC18載體

電轉(zhuǎn)化：連接產(chǎn)物用細胞導入儀電轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌

涂平板、重組子篩選：培養(yǎng)18小時候觀察藍白斑，白斑為重組克隆77ppt課件.培養(yǎng)組

96孔板培養(yǎng)基的分裝挑取克隆過夜培養(yǎng)菌液生長的檢測離心4度貯存

培養(yǎng)的目的是通過大腸桿菌擴增系統(tǒng)，為測序反應提供充足的模板國產(chǎn)96自動分液器培養(yǎng)用96孔深孔板78ppt課件.培養(yǎng)組分裝培養(yǎng)基：8道瓶口分液器1分鐘/板出錯率高工作強度高國產(chǎn)96自動分液器30秒/板杜絕錯誤輕松一按VSVS79ppt課件.模板組

負責測序反應模板DNA的制備。采用堿裂解過膜法從轉(zhuǎn)化獲得的目的重組子大腸桿菌中提取目標產(chǎn)物――插入外源DNA片段的PUC18質(zhì)粒步驟：培養(yǎng)好的克隆加I液（含Tris

、EDTA

）懸浮大腸桿菌加II液（含NaOH、SDS）裂解大腸桿菌，并使DNA、蛋白質(zhì)變性加III液（含乙酸鉀、乙酸）中和，并使DNA復性反應液過膜

收集濾液，棄膜質(zhì)粒DNA的純化80ppt課件.模板組

96孔醋酸鉀法(1999年)96孔亞精胺法(2000年)96孔Millipore過濾膜法