《疫組織化學技術》課件

免疫組織化學技術Immunohistochemistry,IHCImmunocytochemistry,

ICC1基本原理

利用免疫學中抗原與抗體特異性結合的特點以及組織化學的原理，在組織或細胞標本中加入特定的標記抗體，然后對標記物進行顯示，從而對組織或細胞內的抗原物質進行定性、定位或定量研究。免疫酶技術顯示Caspase-3免疫熒光技術顯示MOR2抗原：可被T、B細胞識別，并啟動特異性免疫應答的物質。即抗原可作用于T、B細胞的抗原識別受體，促使其增殖、分化，產生免疫效應物質（抗體或致敏淋巴細胞）并與之結合，從而發(fā)揮免疫效應?？乖膬煞N特性：免疫原性：即能刺激機體產生免疫應答（產生特異性抗體或致敏T細胞）；抗原性：指能與其所誘生的抗體或致敏T細胞特異性結合。完全抗原：同時具備免疫原性和抗原性半抗原：只具備抗原性而不具備免疫原性3抗原決定簇或表位：決定抗原特異性的基本結構或化學基團，是免疫應答特異性的物質基礎?？乖肿颖砻婺軌蚺c抗體結合的表位數(shù)量稱為抗原的價，完全抗原一般均為多價。共同抗原：兩種不同的抗原分子所具有的相同或相似的抗原決定簇稱為共同抗原或共同決定簇。親緣關系很近的生物之間的共同抗原稱為類屬抗原；抗體對具有相同或相似決定簇的不同抗原的反應稱為交叉反應。4影響免疫原性的因素：1.理化特性（大分子蛋白質可含有大量不同的抗原決定簇，是強免疫原；多糖是重要的天然抗原，如細菌內毒素脂多糖、血型抗原；核酸多無免疫原性，但與蛋白結合形成核蛋白則有免疫原性；多肽類激素如胰島素也有免疫原性）、分子量（抗原的分子量一般≥10kD，且分子量越大，免疫原性越強）、結構的復雜性（免疫原性物質還須具備復雜的化學組成與特殊的化學基團，如含大量芳香族氨基酸）、分子構象和抗原決定簇的易接近性等。2.宿主方面的因素：異種性（“非已”－－異種、同種異體、自體抗原－－抗原來源與宿主關系越遠，免疫原性越強）、遺傳因素（個體差異）、年齡、性別與健康狀態(tài)。3.抗原進入機體的方式：抗原的劑量（低劑量和高劑量都不易引起免疫應答）、進入機體的途徑（皮內＞皮下＞肌肉＞腹腔＞靜脈）、免疫次數(shù)（強的免疫應答需要多次注射）、佐劑（可先于抗原或同時與抗原混合注射動物，以增強抗原的免疫原性，即起輔佐抗原作用的物質，如弗氏佐劑）。5

抗體（antibody,Ab）機體免疫細胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細胞——漿細胞合成、分泌的一類能與相應抗原特異性結合的具有免疫功能的球蛋白。是介導體液免疫的重要效應分子。典型的免疫球蛋白分子呈Y字型，由兩條相同的重鏈（heavychain,H）和兩條相同的輕鏈（lightchain,L）借二硫鍵連接而成。在氨基端，重鏈的1/4和輕鏈的1/2氨基酸序列變化很大，為可變區(qū)（variableregion,V）；其他部分氨基酸序列相對恒定，為恒定區(qū)（constantregion,C）。6Fab即抗原結合片段（fragmentantigenbinding），由一條完整的輕鏈和部分重鏈（VH和CH1）組成。該片段具有單價抗體活性，能與一個相應的抗原決定族特異性結合。Fc即可結晶片段（fragmentcrystalline），F(xiàn)c段含有兩條重鏈C端的一半，包含CH2和CH3兩個功能區(qū)，它無抗體活性。Ig在異種間免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段，同時Fc段還具有活化補體、親細胞、通過胎盤和介導與細菌蛋白結合等生物學活性。用木瓜蛋白酶水解IgG分子，可將其裂解為兩個完全相同的Fab和一個Fc片段。7多克隆抗體（polyclonalantibody,PcAb）大多數(shù)天然抗原物質(如細菌或其分泌的外毒素以及各種組織成分等)往往具有多種不同的抗原決定簇，而每一決定簇都可刺激機體產生一種特異性抗體。多克隆抗體是多個抗原決定簇刺激機體后，由多個免疫淋巴細胞分泌的多種抗體的混合物。PcAb特異性差，易出現(xiàn)交叉反應。8由單一克隆B細胞雜交骨髓瘤細胞產生的，只識別一種抗原表位的具有高度特異性的抗體。優(yōu)點：結構均一、純度高、特異性強、效價高、易大量制備。制備單一表位特異性抗體的理想方法是獲得針對單一表位的漿細胞克隆，使其在體外擴增并分泌抗體。但漿細胞在體外的壽命較短，也難以培養(yǎng)。于是，將可產生特異性抗體但短壽的漿細胞與無抗原特異性但長壽的惡性漿細胞瘤細胞融合，建立了可產生單克隆抗體的雜交瘤細胞和單克隆抗體技術。

單克隆抗體（monoclonalantibody,McAb）9免疫組織化學方法熒光標記免疫組織化學酶聯(lián)免疫組織化學10直接法：用酶或其他標記物標記的特異性抗體直接與標本中的相應抗原結合，再與酶的底物作用產生有色產物，沉積在抗原抗體反應的部位，即可對抗原進行定性、定位以至定量研究。TissueAntigenLabeledAntibody11間接法：第一抗體不標記，使用與第一抗體種屬相同的抗體Fc段（有種屬特異性）作為抗原免疫動物，制備抗抗體，即第二抗體，并標記第二抗體。TissueAntigenPrimaryAntibodySecondaryAntibody12酶聯(lián)免疫組織化學ABC法S-P法13親合素–生物素–過氧化物酶復合物法（avidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,ABC法）1.生物素與親合素有很高的親和力2.一個親合素分子上有四個生物素結合位點3.將親合素作為“橋”將生物素化的抗體與生物素結合的酶連接起來，使抗原與抗體反應信號放大，以增強敏感性14鏈霉親合素–生物素–過氧化物酶復合物法（streptavidin-biotin-peroxidasecomplexmethod,SABC法）

此法為上述ABC法的改良，是用鏈霉親合素（streptavidin）代替ABC法中的親合素（avidin）Streptavidin鏈霉親合素avidin親合素鏈霉親合素為蛋白質，非糖蛋白，不與其它分子結合，可降低背景。親合素是糖蛋白，含有約7%的糖類，可與組織中含糖基的物質起反應，造成背景著色。15鏈霉親合素-過氧化物酶法（streptavidinperoxidase，S-P法）Streptavidin鏈霉親合素酶標鏈霉親合素鏈霉親合素對組織的穿透性強，反應速度快；鏈霉親合素的等電點接近中性（5.5～6.7,而親合素為10左右），所帶負電荷少，不容易與組織中的正電荷發(fā)生相互吸引，因此可降低背景著色；S-P法的放大系統(tǒng)不含生物素，可免除內源性生物素所造成的背景著色。16免疫組織化學酶類標記物滿足條件：酶催化底物必須是特異的，并容易被顯示（產物易于鏡下觀察）；酶反應形成的終產物必須是穩(wěn)定的沉淀，不能從酶活性部位向周圍組織彌散；容易獲?。儯?；中性pH值時，具有穩(wěn)定性；酶標記至抗體上不影響酶和抗體的活性。17常用酶類標記物辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）H2O2和DAB（diaminobenzidine,

二氨基聯(lián)苯胺）為其常用底物，產物為穩(wěn)定的棕黃色沉淀18堿性磷酸酶（alkalinephosphatase,AP）：BCIP

(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate，5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽)和NBT（Nitro-Blue-Tetrazolium，四唑氮藍）是AP的常用底物組合，其中，NBT作為氧化劑,BCIP作為AP底物。BCIPBCIP被AP水解成一種藍色的中間物，后者然后被NBT氧化形成二聚體（不溶性紫藍色沉淀）。19

DoublestainingusingDABandBCIP/NBT20免疫組織化學技術的基本要求1、有高度特異性；2、有高度敏感性；3、不引起受檢物質的移位和丟失；4、不影響抗原和抗體的免疫活性；5、不損傷組織和細胞的本來結構；6、免疫結合物借標記物明顯可見21免疫組織化學標本的制備22一、組織的固定

1、目的：固定抗原的定位保存組織細胞的形態(tài)結構

2、常用固定劑和固定液：甲醛、多聚甲醛、戊二醛等

3、作用和缺點：固定組織和保存抗原抗原易被掩蓋23二、固定的方法（一）方法：推注，滴注（二）滴注步驟：1、開胸2、暴露心臟3、自心尖剪開左心室4、插入灌流針至主動脈弓5、固定灌流針6、快速注入沖洗液（有時可免）7、先快后慢注入固定液

8、慢注畢，將動物裝入含

有少量固定液的塑料袋置4oC冰箱內靜置2h后取材24三、組織包埋和切片（一）石蠟包埋切片（二）恒冷箱切片

25（一）石蠟包埋切片（二）恒冷箱切片：防冰晶

1、驟凍

2、10?30%蔗糖溶液異戊烷干冰組織塊冰凍切片包埋模具配套O.C.T包埋劑使用

26免疫組織化學染色程序27以ABC法為例組織抗原生物素化二抗ABC一抗28染色程序:

組織采用石蠟切片或恒冷箱切片,片厚5～10m或者10～

15m

。

若石蠟切片則脫蠟到水

1、PBS漂洗,10min；29染色程序:

2、10%NSS（或者3%BSA）,30min；

3、1%TritonX-100,3%H2O2處理，30min;4、

兔抗血清孵育過夜；

4、PBS漂洗,35min；

5、生物素化羊抗兔IgG

孵育,60min；

6、PBS漂洗，35min；載玻片標簽組織切片生物素化二抗生物素30染色程序:7、ABC復合物孵育,60min；8、PBS漂洗,35min；9、DAB?H2O2顯色液顯色，至深棕色為止，約5～10min；（DAB?H2O2臨用前配制）ABC標簽組織切片ABC31染色程序:10、先后經自來水沖洗和雙蒸水浸洗；11、常規(guī)脫水、透明、樹膠封片。32染色結果：鏡下觀察。陰性對照試驗：

1、常用空白試驗：即用稀釋一抗的稀釋液，如10% NSS等，或PBS替代一抗，反應應呈陰性；2、替代試驗：正常兔血清或正常羊血清代替兔抗血清或羊抗兔IgG，反應應呈陰性；3、吸附試驗：一抗血清經相應抗原預吸附處理后孵育組織切片，反應應呈陰性。33切片載玻片的清潔：

切片粘合劑的使用：

（1）多聚賴氨酸（分子量300KD）：0.5%濃度涂片。

（2）APES干凈載玻片→丙酮5min→用鑷子夾住浸入APES試劑（1ml+50ml丙酮）1～3次→純丙酮洗二次→干燥玻片(37℃過夜)→用鋁箔包好，室溫或4℃保存?zhèn)溆?。?）鉻礬明膠液：鉻礬0.5g明膠5gH2O1000ml

34細胞爬片制作將處理好的蓋玻片放入接種了細胞的培養(yǎng)瓶或六孔板內。待細胞生長達到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上?？杉痈视头獯嬷糜诹阆?0度保存。35細胞涂片制作離心將細胞收集出來，用預冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS將細胞重懸。吸取30－50ul（可根據細胞量調整）滴至處理過的載玻片上，然后涂抹均勻。待稍微風干以后加4％多聚甲醛溶液覆蓋細胞，固定2－4小時。在細胞上加一層甘油放-20℃保存。細胞離心涂片機是利用液動與氣動原理,將收集的細胞樣本進行了細胞分散,過濾從其混懸液中分離出來,均勻的噴涂在玻片上。36抗原修復免疫組織化學方法成功與否關鍵在于抗原決定簇的保存和暴露。組織經甲醛固定，甲醛的醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)，使抗原決定簇被掩蓋，從而影響對蛋白表達的檢測。要充分暴露抗原決定簇，通常用到抗原修復。加熱抗原修復法酶消化法37高壓加熱修復法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理切片10min;

③蒸餾水洗;

④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中，連同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)1－4min;

⑤待修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學染色方法進行染色。38電爐加熱修復法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理切片10min;

③蒸餾水洗;

④將切片放入抗原修復液中于電爐上加熱，不時用溫度計測量溫度，當達92℃后，即可拔離電源，當溫度低于92℃時，再插上電源，如此反復持續(xù)至10min左右;

⑤待抗原修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進行染色。

39Steamingtemperaturebetween95oC-98oCwhichisoptimalformostofantigens.settheTimerfor40minutesthatissufficientforretrievingmostantigens(someantigensneedlongersteamingtimesooptimalsteamingtimeshouldbedeterminedbyuser).

IHC-TekTMEpitopeRetrievalSteamerSet

40微波修復法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理10min;

③蒸餾水洗;

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），于微波爐內微波輻射10min;

⑤待修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學染色方法進行染色。

Heat-inducedEpitopeRetrieval(HIER)HIERisbelievedtoreversesomecross-linksandallowsforrestorationofsecondaryortertiarystructureoftheepitope.Theprotocolmustbeoptimizedforeachtissue,fixationmethod,andantigentobestudied.Ingeneral,HIERhasamuchhighersuccessratethanPIER.HIERisperformedusingmicrowaveovens,pressurecookers,vegetablesteamers,autoclaves,orwaterbaths.MicrowavesareanincreasinglypopularapplianceforHIER.Theseprotocolstendtoinvolve5minuteperiodsofheatfollowedbyreplacementofthebuffer.ForallHIERmethods,slidesmustbecooledbeforecommencingIHC/ICCincubations.HIERisespeciallytime-,temperature-,buffer-,andpH-sensitive,andthebestmethodmustbedeterminedempirically.4142R&DSystemsoffersreagentstoimprovetissueantigendetectionandenhanceimmunoreactivity.Duringinitialoptimization,investigatorscancomparesamplestreatedwithneutralpH7.0UniversalAntigenRetrievalSolution(Catalog#CTS015)withaslideofthesametissuewithoutantigenretrieval.Subsequenttestsusingacidicorbasicantigenretrievalsolutionsmaybenecessarydependingonthetissue.AtR&DSystems,wefindthattreatmentwithBasicAntigenRetrievalreagent(pH9.5,Catalog#CTS013)isfrequentlysuccessful.WealsoofferAcidic(pH5.0,

Catalog#CTS014)andSampler(Catalog#CTS016)AntigenRetrievalReagents.Acidicandbasicantigenretrievalsolutionsaremorelikelytoaffecttissuemorphologythananeutralsolution.Thetime,temperature,andpHmustalsobeoptimizedforeachappliance(i.e.5-10minutesat92-95°Cinawaterbath,versus1-5minutesat120°Cinapressurecooker).43胃蛋白酶消化法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理切片10min;

③蒸餾水洗;

④PBS洗3次;

⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，處理切片20min左右;

⑥PBS沖洗3次;

⑦按選擇好的免疫組化該法進行染色。

Protease-inducedEpitopeRetrieval(PIER)InthePIERmethod,enzymesincludingProteinaseK,Trypsin,andPepsinhavebeenusedsuccessfullytorestorethebindingofanantibodytoitsepitope.Themechanismofactionisthoughttobethecleavageofpeptidesthatmaybemaskingtheepitope.ThedisadvantagesofPIERarethelowsuccessrateforrestoringimmunoreactivityandthepotentialfordestroyingbothtissuemorphologyandtheantigenofinterest.44胰蛋白酶消化法

①切片脫蠟至水;

②0.3%H2O2甲醇處理切片10min;

③蒸餾水洗;

④PBS洗3次;

⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，處理切片20min左右;

⑥PBS洗3次;

⑦按選好的免疫組化染色方法進行染色。

45注意事項一、抗體的保存

濃縮抗體：有效期內，只需放在4℃冰箱內，保存時間可達1-3年。即用型抗體：理論上在4℃冰箱內可保存半年左右。

PBS或抗體稀釋液稀釋的抗體：一般只可放置1-2個月。46二、出現(xiàn)假陽性的原因

組織切片質量不佳，造成假象，如刀痕裂縫邊緣的組織著色過深，不能作為判斷陽性的依據。出血和壞死：紅細胞的內源性過氧化物酶，壞死細胞釋放的內源性過氧化物酶均可出現(xiàn)假陽性反應。抗體的交叉反應。47三、出現(xiàn)假陰性的原因

固定時間過長，浸蠟、烤片溫度過高，導致抗原丟失，無法補救。固定液不合適或濃度不對，導致固定不佳。最好使用10%中性福爾馬林?？贵w濃度過低。孵育時間太短，或孵育溫度太低。緩沖液pH值不正確。48四、必須嚴格設置陽性對照和陰性對照。五、DAB有致癌性，用后不應隨處倒棄。491.Antigenretrieval

ProteolyticenzymemethodandHeat-inducedmethod2.Inhibitionofendogenoustissuecomponents

3%H2O2,0.01%avidin3.Blockingofnonspecificsites10%normalserum

pretreatment50PositiveControlItistotestforaprotocolorprocedureused.Itwillbeidealtousethetissueofknownpositiveasacontrol.

NegativeControl

Itistotestforthespecificityoftheantibodyinvolved.

Controls

51Example1.Prepareandfixtissue2.Antigenretrieval3.Suppressendogenousperoxidaseactivity4.Blocknonspecificsitesinthetissues5.Incubatethetissueswiththeprimaryantibody6.Incubatethetissueswiththesecondaryantibody7.IncubatethetissueswithSP8.AddDABandincubateuntildesiredstainingisachieved

52Troubleshooting1.WeakorNo

Staining

2.Over-staining

3.HighBackground

53WeakorNoStaining

Sources

Solutions

InadequatedeparaffinizationDeparaffinizesectionslongerorchangefreshxyleneInactiveprimaryantibodiesReplacewithanewbatchofantibodiesAntibodiesdonotworkduetoimproperstorageAliquotantibodiesintosmallervolumesandstoreinfreezer(-20to-70℃)andavoidrepeatedfreezeandthawcycles.AntibodyconcentrationwastoolowIncreasetheconcentrationofantibodies.OrrunaserialdilutiontesttodeterminetheoptimaldilutionthatgivesthebestsignaltonoiseratioInadequateantibodyincubationtimeIncreaseantibodyincubationtimeInadequateorimpropertissuefixationIncreasedurationofpostfixationortrydifferentfixatives54WeakorNoStaining

Sources

Solutions

TissueoverfixationReducethedurationofpostfixationorperformanappropriateantigenretrievalprocedureIncompatiblesecondaryandprimaryantibodiesUsesecondaryantibodythatwillinteractwithprimaryantibody.InactivesecondaryantibodyorotherreagentsReplacewithanewbatchofreagentsInadequatesubstrateincubationtimeIncreasethesubstrateincubationtimeIncorrectmountingmediumChooseacorrectmountingmediumReagentsappliedinwrongorderorstepsomittedChecknotesorprocedureused55Over-staining

Sources

Solutions

TheconcentrationofantibodieswastoohighReduceantibodyconcentrationorperformatitrationtodeterminetheoptimaldilutionforprimaryandsecondaryantibodiesIncubationtimewastoolongReduceincubationtimeIncubationtemperaturewastoohighReduceincubationtemperatureSubstrateincubation

timewastoolongReducesubstrateincubationtimeSectionsdriedoutAvoidsectionsbeingdriedout56HighBackground

SourcesSolutions

InadequatewashingofsectionsWashatleast3timesbetweenstepsTissuecontainsendogenousenzymeBlockendogenousenzymeactivitiesTissuecontainsendogenousbiotinactivityBlockendogenousbiotinactivityusingtheavidin/biotinblockingreagentpriortoincubationofprimaryantibodies.Non-specificbindingofprimaryantibodiestotissueorhighantibodyconcentrationNon-specificbinding

maybereducedbyusinghigherdilutionofprimaryantibodies

Non-specificbindingofsecondaryantibodiestotissueTreattissuewithnormalserumblockfromthesamespeciesassecondaryantibodiesDiffusionoftissueantigenduetoinadequatefixationIncreasedurationofpostfixation5758596061免疫熒光組織化學技術將熒光作為標記物的免疫組織化學技術62熒光（fluorescence）當某種常溫物質經某種波長的入射光（通常是紫外線或X射線）照射，吸收光能后進入激發(fā)態(tài)，并且立即退激發(fā)并發(fā)出比入射光的的波長長的出射光（通常波長在可見光波段）；而且一