生物大分子提取技術(shù)-課件

1ppt課件桂花贊幾度風(fēng)雨一場(chǎng)涼人間迎來(lái)桂花芳銀桂周身亮繁星丹桂濃妝新嫁娘枝頭鳥(niǎo)雀絮絮贊樹(shù)下騷客搜枯腸清風(fēng)淡云圓月下乾坤萬(wàn)里共清香2ppt課件生物大分子分離純化的意義①生命科學(xué)研究的需要：從生物材料中分離制備核酸、蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)需要：是分析標(biāo)本中包含的分子信息的前提條件，對(duì)于精確診斷疾病具有重要意義。③醫(yī)療實(shí)踐的需要：如用胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要：基因工程疫苗和藥物。3ppt課件中心法則4ppt課件核酸、蛋白質(zhì)（酶）是重要的生物大分子存在于一切生物體中核酸是遺傳信息的攜帶者在有機(jī)體內(nèi)指導(dǎo)各種蛋白質(zhì)的合成。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、生長(zhǎng)調(diào)控以及記憶、識(shí)別等多種生理功能。5ppt課件核酸-DNA與RNA結(jié)構(gòu)6ppt課件脫氧腺嘌呤核苷A7ppt課件A-T對(duì)G-C對(duì)8ppt課件5’CGAATCAGAA3’

3’GCTTAGTCTT5’

雙鏈DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)9ppt課件核酸的性質(zhì)DNA:雙螺旋;RNA單鏈帶電性-----電泳水溶性------溶液變性、復(fù)性-------分子雜交光吸收性質(zhì)-------濃度\純度測(cè)定DNA增色效應(yīng)------TM值測(cè)定10ppt課件蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)11ppt課件12ppt課件蛋白質(zhì)性質(zhì)雙帶電性-----電泳\等電點(diǎn)水溶性\脂溶性------溶液分子間識(shí)別-------抗原抗體反應(yīng)光吸收性質(zhì)-------濃度\純度測(cè)定變性13ppt課件生物大分子分離純化的一般程序①材料的選擇和預(yù)處理②破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）③分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化的前處理。14ppt課件一、材料的選擇與預(yù)處理選材，科研選材則無(wú)需考慮上述問(wèn)題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯?。臨床選材則要考慮病人的依從性。預(yù)處理，如動(dòng)物材料需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無(wú)關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開(kāi)。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或加工，應(yīng)冷凍保存。15ppt課件應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎，生物大分子從原來(lái)的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來(lái)，并保持原來(lái)的天然狀態(tài)和生物活性。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。二、組織細(xì)胞的破碎16ppt課件一般動(dòng)物組織和細(xì)胞可用電動(dòng)搗碎機(jī)或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細(xì)胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細(xì)胞壁，一般常用與石英砂和適當(dāng)?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能達(dá)到目的。細(xì)菌細(xì)胞的破碎比較困難，因?yàn)檎麄€(gè)細(xì)菌細(xì)胞壁的骨架實(shí)際上是一借共價(jià)鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅(jiān)韌。破碎的方法常有超聲波、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理（以分解肽聚糖）。組織細(xì)胞的破碎方法17ppt課件細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細(xì)胞還有葉綠體。如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來(lái)，然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。采用差速離心法分離細(xì)胞器，即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過(guò)不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。三、細(xì)胞器的分離18ppt課件將組織細(xì)胞破碎，使目標(biāo)分子被釋放出來(lái)，并將其與其它細(xì)胞成分分離,這就是提取。在此過(guò)程中，必須立即將細(xì)胞勻漿液置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來(lái)的天然狀態(tài)，避免因長(zhǎng)久放置造成制備物的分解破壞，四、提取19ppt課件從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這一階段可分為粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離兩步進(jìn)行。五、分離純化20ppt課件核酸分離純化的一般程序破碎細(xì)胞或組織提取純化21ppt課件核酸提取技術(shù)DNA提取技術(shù)原理、方法、應(yīng)用RNA提取技術(shù)原理、方法、應(yīng)用22ppt課件核酸提取的要求1、純度：2、完整度：3、活性：4、收率：5、速度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如用于基因擴(kuò)增的模板DNA純度要求較低，而用于治療的DNA則純度要求很高。大分子完整度越高越好。要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。希望收率越高越好，但在分離純化過(guò)程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。越快速越好。23ppt課件DNA的提取純化本質(zhì)：將DNA從組織或細(xì)胞中分離沉淀出來(lái)。要求：去除雜蛋白、多糖、脂類等大分子雜質(zhì)，同時(shí)要快速簡(jiǎn)便。常用的提取方法：酚-氯仿提取法鹽析法高溫裂解法固相吸附洗脫法碘化鈉提取法磁珠分離法24ppt課件舉例:外周血DNA提取的方法步驟1、標(biāo)本預(yù)處理：1mlEDTA抗凝貯凍血于室溫解凍后移入5ml離心管中，加入1ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS），混勻，3500g離心15min,傾去上清。重復(fù)一次。用0.7mlDNA提取液混懸白細(xì)胞沉淀，37℃水浴溫育1h。2、消化：上述DNA提取液混懸白細(xì)胞，37℃水浴溫育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至終濃度為100-200ug/ml,上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，液體變粘稠。50℃水浴保溫3h，裂解細(xì)胞，消化蛋白。保溫過(guò)程中，應(yīng)不時(shí)上下轉(zhuǎn)動(dòng)幾次，混勻反應(yīng)液。

25ppt課件3.酚抽提純化DNA：冷卻至室溫后，加入等體積的飽和酚溶液，溫和地上下轉(zhuǎn)動(dòng)離心管5-10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5000g離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復(fù)酚抽提一次。加等體積的氯仿﹕異戊醇（24﹕1），上下轉(zhuǎn)動(dòng)混勻，5000g離心15min，用大口吸管小心吸取上層粘稠水相，移至另一離心管中。重復(fù)一次。4.沉淀DNA：加入1/5體積的3mol/LNaAc及2倍體積的冷無(wú)水乙醇，室溫下慢慢搖動(dòng)離心管，即有乳白色云絮狀DNA出現(xiàn)。用玻璃棒小心挑取云絮狀的DNA，轉(zhuǎn)入另一1.5ml離心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g離心5min洗滌DNA，棄上清。重復(fù)一次。室溫?fù)]發(fā)殘留的乙醇，但不要讓DNA完全干燥。加TE液適量溶解DNA，DNA完全溶解通常需12-24小時(shí)。26ppt課件5.DNA的濃度測(cè)定及純度判定：取DNA溶液用TE液做適量稀釋，以TE液作空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)上讀取A260和A280的光密度值。

按下面公式計(jì)算濃度：DNA濃度(ug/ul)=A260*50*稀釋倍數(shù)/1000

DNA純度的判定：A260/A280比值應(yīng)介于1.7-1.8之間。27ppt課件人基因組DNA28ppt課件RNA的提取純化意義：完整RNA的提取和純化，是進(jìn)行RNA研究工作如Nothern雜交、mRNA分離、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及體外翻譯等實(shí)驗(yàn)的前提。29ppt課件關(guān)鍵點(diǎn):１）樣品細(xì)胞或組織的有效破碎；２）有效地使核蛋白復(fù)合體變性；３）對(duì)內(nèi)源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地將ＲＮＡ從ＤＮＡ和蛋白混合物中分離；5）對(duì)于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去。30ppt課件RNA的提取途徑：1)提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來(lái)；該提取方法將導(dǎo)致小分子量RNA的丟失，目前已很少使用。2)直接在酸性條件下用酚-氯仿抽提，異丙醇沉淀，再用乙醇洗滌沉淀，即可去除幾乎所有殘留的蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽。因?yàn)樗嵝詶l件下DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)入有機(jī)相而RNA留在水相。31ppt課件舉例：組織（細(xì)胞）總RNA提取1、

試劑耗材準(zhǔn)備RNA提取緩沖液：4M異硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉、100mMβ-巰基乙醇；飽和酚：氯仿：異戊醇（50：49：1）；3M醋酸鈉pH5.2；DEPC處理的去離子水：0.5%DEPC的去離子水，充分搖勻，放置4小時(shí)以上，蒸汽高壓滅菌，分裝成小份；RNA酶抑制劑；15ml、1.5ml等離心管，0.1%DEPC浸泡過(guò)夜，蒸汽高壓滅菌。32ppt課件2操作步驟1）將10-30mg組織加入1mlRNA提取緩沖液，勻漿化；或?qū)?mlRNA提取緩沖液加入1瓶培養(yǎng)細(xì)胞（10E6-10E7細(xì)胞），充分混勻，并使細(xì)胞裂解；2）4℃/12000rpm離心10分鐘，上清轉(zhuǎn)移到另一干凈的離心管；3）加入等體積飽和酚：氯仿：異戊醇，混勻，冰浴10分鐘；4）4℃/12000rpm離心5分鐘，小心轉(zhuǎn)移水相；33ppt課件5）氯仿：異戊醇抽提一次，轉(zhuǎn)移水相；6）加入1/10體積的3M醋酸鈉和2.5倍無(wú)水乙醇，混勻，冰浴1小時(shí)；7）4℃/14000rpm離心10分鐘；8）棄上清，75%乙醇洗一次，真空干燥20分鐘；9）加入20-50ulDEPC處理水溶解RNA，可加入少量RNA抑制劑；或加入1ml乙醇和1/10體積3M醋酸鈉（pH5.2），-20℃--70℃保存34ppt課件核酸的純化1、粗分級(jí)分離從細(xì)胞中提取得到的核酸，常混雜有蛋白質(zhì)及各種大小的核酸同類物等雜質(zhì)，可采用適當(dāng)方法進(jìn)行粗提純。粗提純中，進(jìn)一步將蛋白質(zhì)除去,可用去污劑或有機(jī)溶劑多次反復(fù)提取。從RNA除去混雜的DNA，可用DNase將DNA降解掉。從DNA中除去混雜的RNA，可用RNase將RNA降解掉。35ppt課件2、精分級(jí)分離核酸樣品進(jìn)行精提純，一般常用超離心、電泳、柱層析等方法。超離心包括速度區(qū)帶離心、沉降平衡超離心。電泳包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖電泳。前者凝膠孔徑小，適合分離1000個(gè)核苷酸以下的核酸分子。后者孔徑大，適合分離較大的核酸分子。柱層析主要有凝膠過(guò)濾柱層析、離子交換層析、羥基磷灰石柱層析。36ppt課件3、純度鑒定：

核酸的純度鑒定一般采用瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠電泳，沉降分析和紫外吸收（A260/A280）等方法。RNA的濃度測(cè)定及純度判定：取RNA溶液用DEPC處理的純水做適量稀釋，以純水作空白對(duì)照，在紫外分光光度計(jì)上讀取A260和A280的光密度值。

按下面公式計(jì)算濃度：

RNA濃度(ug/ul)=A260*40*稀釋倍數(shù)/1000RNA純度的判定：A260/A280比值應(yīng)介于1.8-2.0之間。37ppt課件38ppt課件一、蛋白質(zhì)（酶）的分離純化蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來(lái)的。性質(zhì)方法分子大小透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過(guò)濾溶解度等電點(diǎn)沉淀、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀電荷電泳、離子交換層析吸附性質(zhì)吸附層析（羥基磷灰石層析、疏水作用層析）對(duì)配體分子親和層析的生物親和力39ppt課件主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開(kāi)，這些方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。1、粗分級(jí)分離40ppt課件（1）鹽析向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[（NH4)2SO4，Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用是由于當(dāng)鹽濃度較高時(shí)，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來(lái)溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層。41ppt課件

不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣