分子生物技術-核酸分子雜交技術

核酸分子雜交技術目錄一、核酸分子雜交基本原理二、核酸探針三、核酸分子雜交相關技術一、核酸分子雜交基本原理(一)

核酸的變性與復性1.變性當有酸、堿、熱及某些變性劑(如尿素、乙醇、甲酰、胺、胍等)等變性因素存在時,DNA分子雙鏈間的氫鍵斷裂,解離成兩條無規(guī)則的卷曲狀單鏈DNA,此現(xiàn)象稱為變性一、核酸分子雜交基本原理(一)

核酸的變性與復性2.復性去除變性因素后,單鏈DNA能通過堿基互補重新結合成穩(wěn)定的雙鏈螺旋結構,此過程稱為復性一、核酸分子雜交基本原理(一)

核酸的變性與復性2.復性DNA復性后,許多理化性質和生物活性也得到恢復。復性過程基本上符合二級反應動力學,其中第一步是相對緩慢的,因為兩條鏈必須依靠隨機碰撞找到一段堿基配對部分,先形成部分雙螺旋。第二步快得多,尚未配對的其他部分按堿基配對相結合,像拉鎖鏈一樣迅速形成雙螺旋一、核酸分子雜交基本原理(二)

核酸分子雜交基本原理根據(jù)核酸變性和復性的原理,不同來源的DNA變性后,若這些異源DNA之間存在某些相同序列的區(qū)域,在退火條件下則可形成DNA-DNA異源雙鏈;或將變性的單鏈DNA與RNA經(jīng)復性處理可以形成DNA-RNA雜合雙鏈。這種不同來源的單鏈核酸分子在合適的條件下,通過堿基互補形成雙鏈雜交體的過程稱為核酸分子雜交二、核酸探針核酸探針是指能與待測的靶核酸序列互補雜交的已知序列的核酸片段。它具有高度的特異性,并且一般來講帶有某種適當?shù)臉擞浺员銠z測根據(jù)標記方法不同,核酸探針可被粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類;根據(jù)性質及來源不同,核酸探針又可被分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針及寡核苷酸探針等幾類三、核酸分子雜交相關技術（一）傳統(tǒng)核酸分子雜交技術

1.Southern雜交

2.Northern雜交

3.斑點雜交與狹縫雜交（二）原位雜交技術三、核酸分子雜交相關技術（一）傳統(tǒng)核酸分子雜交技術1.Southern雜交Southern雜交是分子生物學的經(jīng)典實驗方法基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上(硝酸纖維素膜或尼龍膜),與標記的核酸探針進行雜交,在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號三、核酸分子雜交相關技術（一）傳統(tǒng)核酸分子雜交技術2.Northern雜交對RNA的檢測也可以利用與DNA檢測相同的印跡技術來分析。與Southern印跡雜交的方法類似,只是變性劑不同Southern雜交中使用的使DNA變性的試劑為NaOH。因為NaOH會水解RNA的2-羥基基團,所以Northern雜交中使RNA変性的試劑為甲基氧化汞、乙二醛或甲醛三、核酸分子雜交相關技術（一）傳統(tǒng)核酸分子雜交技術3.

斑點雜交與狹縫雜交將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上,再采用特定的探針進行雜交這種方法稱為點雜交若采用狹縫點樣器加樣后雜交,則稱為狹縫雜交斑點雜交與狹縫雜交的區(qū)別是點樣形狀的不同三、核酸分子雜交相關技術斑點雜交和狹縫雜交都是將被檢標本點到膜上烘烤固定。不需電泳和轉膜過程,整個操作過程簡便、快速缺點是無法判斷核酸片段的大小,也無法判斷樣品溶液中是否存在著不同的靶序列,多用作核酸定性或半定量分析而且便于雜交條件的摸索三、核酸分子雜交相關技術（二）核酸原位雜交原位雜交是將核酸分子雜交技術與組織細胞化學和免疫組織化學結合起來的一種雜交方法,其基本原理及探針的標記方法與傳統(tǒng)核酸分子雜交技術相同三、核酸分子雜交相關技術（二）核酸原位雜交不同之處是原位雜交可以確定與探針互補的核酸序列在細胞內(nèi)