中藥制劑含量測定技術(shù)-高效液相色譜法

CONTENTDETERMINATIONTECHNOLOGYOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEPREPARATIONS–OPERATIONSTEPSOFHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法的操作步驟案例導(dǎo)入固本咳喘片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定本品是由黨參、白術(shù)（麩炒）、茯苓、麥冬、鹽補(bǔ)骨脂、炙甘草、醋五味子加工而成的片劑采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定，本品中含補(bǔ)骨脂的量以補(bǔ)骨脂素和鹽補(bǔ)骨脂素的含量計算測定前先要進(jìn)行色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液45：55為流動相；檢測波長為246nm。理論板數(shù)按補(bǔ)骨脂素峰計算應(yīng)不低于2000高效液相色譜儀應(yīng)該如何操作?案例導(dǎo)入固本咳喘片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗包含了哪些內(nèi)容？進(jìn)行這項試驗有何意義？中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法一、概述高效液相色譜法（HPLC）是采用高壓輸液泵將流動相泵入到裝有填充劑的色譜柱中進(jìn)行分離并測定含量的方法高效液相色譜儀一般由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)共同組成中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法測定前：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法色譜條件一般包括填充劑（固定相）、流動相、檢測波長、洗脫方式等系統(tǒng)適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復(fù)性等參數(shù)二、高效液相色譜儀的操作步驟其中理論板數(shù)、分離度都是色譜柱柱效的評價因素例：復(fù)方丹參片含量測定理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計算應(yīng)不低于2000中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（1）用流動相沖洗濾器，再把過濾頭浸入流動相中，啟動泵開關(guān)

1.泵的操作（2）打開泵的排放閥，用沖洗鍵(PURGE)進(jìn)行泵排氣，一般約需3分鐘，然后關(guān)閉排放閥（3）將流速調(diào)節(jié)至分析用流速，對色譜柱進(jìn)行平衡，同時觀察壓力指示應(yīng)穩(wěn)定，初始平衡時間一般需約30分鐘中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（1）開啟檢測器電源開關(guān)，選擇光源，選定檢測波長，待穩(wěn)定后，測試參比和供試品光路的信號應(yīng)符合要求

2.檢測器和色譜工作站的操作（2）開啟色譜工作站，設(shè)定處理方法，初步設(shè)定電壓范圍、時間范圍等參數(shù)（3）記錄基線，待基線穩(wěn)定后方能進(jìn)行后續(xù)操作中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（1）調(diào)節(jié)進(jìn)樣手柄置于采樣位置(LOAD)

3.進(jìn)樣操作-六通閥式進(jìn)樣器（手動進(jìn)樣器）（2）用待進(jìn)樣溶液清洗配套的微量注射器，再用注射器抽取適量溶液，排除氣泡（3）把注射器的平頭針直插至進(jìn)樣器底部，注入待測溶液，整個過程注射器不應(yīng)取下（4）將進(jìn)樣器手柄轉(zhuǎn)至進(jìn)樣位置(INJECT)，此時樣品溶液被流動相帶入色譜柱中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（1）將待測溶液用0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液至進(jìn)樣瓶中，蓋上帶有墊片的瓶蓋，順時針方向旋緊

3.進(jìn)樣操作-自動進(jìn)樣器（2）將樣瓶依次放入貯樣室內(nèi)，記錄樣瓶位置號（3）對自動進(jìn)樣器進(jìn)行檢查校正，使自動進(jìn)樣器為默認(rèn)位置，檢查進(jìn)樣針沖洗系統(tǒng)是否正常、管路內(nèi)是否無氣泡、是否具有足夠的沖洗液和流動相（4）設(shè)定自動進(jìn)樣參數(shù)，包括供試品溶液自動進(jìn)樣的起始位置、進(jìn)樣體積、數(shù)據(jù)文件名等中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（1）進(jìn)樣的同時啟動色譜工作站，開始采集和處理色譜信息

4.色譜數(shù)據(jù)的收集和處理（2）組分的最后一峰出完后應(yīng)繼續(xù)走一段基線，確認(rèn)再無組分流出后方能結(jié)束（3）含量測定的對照品溶液和供試品溶液每份至少進(jìn)樣2次，由全部進(jìn)樣結(jié)果(n≥4)求得平均值，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不應(yīng)大于1.5％（4）色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗應(yīng)符合《中國藥典》2020年版通則規(guī)定中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（1）分析完畢，先關(guān)檢測器和色譜工作站，再用經(jīng)濾過和脫氣的適當(dāng)溶劑清洗色譜系統(tǒng)，各種沖洗劑一般沖洗15-30分鐘

5.清洗和關(guān)機(jī)（2）沖洗完畢后逐步降低流速至0，關(guān)泵。進(jìn)樣器也應(yīng)用相應(yīng)溶劑沖洗，可用進(jìn)樣閥所附專用沖洗接頭（3）關(guān)閉電源，作好使用登記，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、柱壓、使用時間以及儀器使用前后的狀態(tài)等中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（1）進(jìn)樣前色譜柱應(yīng)用流動相充分沖洗平衡，如系統(tǒng)適用性不符合規(guī)定，或填充柱已損壞，則應(yīng)更換色譜柱再進(jìn)行分析操作注意事項（2）以硅膠為載體的化學(xué)鍵合相的穩(wěn)定性受流動相pH值的影響，使用時應(yīng)注意在規(guī)定的pH值范圍內(nèi)選擇流動相，一般pH值范圍在2.5-7.5（3）色譜流通系統(tǒng)從泵、進(jìn)樣器、色譜柱到檢測器流通池，在分析完畢后均應(yīng)充分沖洗，特別是使用過含鹽流動相的，更應(yīng)該注意先用水，再用甲醇-水或乙腈-水充分沖洗鏈接未來崗位中藥制劑中有效成分或特征性指標(biāo)成分含量的測定對于評價中藥質(zhì)量的優(yōu)劣具有重要意義，同時也是藥品質(zhì)量檢驗中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本講內(nèi)容既是知識體系中的重點(diǎn)內(nèi)容，也是崗位工作中的重要技能作為一名藥品檢驗人員，須牢固樹立“質(zhì)量第一、安全操作”的意識，牢固掌握高效液相色譜儀的操作方法和注意事項，細(xì)致準(zhǔn)確的記錄檢驗結(jié)果，確保檢驗結(jié)果的真實可靠小結(jié)高效液相色譜法的原理和儀器工作的基本流程高效液相色譜儀的操作方法步驟以及注意事項思考題在進(jìn)樣前和結(jié)束測定后為什么都要使用流動相對色譜柱進(jìn)行充分沖洗？CONTENTDETERMINATIONTECHNOLOGYOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEPREPARATIONS–PRINCIPLEANDINSTRUMENTSTRUCTUREOFHIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法的原理和儀器構(gòu)造案例導(dǎo)入固本咳喘片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定本品是由黨參、白術(shù)（麩炒）、茯苓、麥冬、鹽補(bǔ)骨脂、炙甘草、醋五味子加工而成的片劑采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定，本品中含補(bǔ)骨脂的量以補(bǔ)骨脂素和鹽補(bǔ)骨脂素的含量計算含量測定使用的儀器是高效液相色譜儀，使用前先要進(jìn)行色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗，隨后還要用配制好的流動相對高壓輸液泵及其管路進(jìn)行排氣、平衡等操作，將供試品和對照品依次進(jìn)樣，在色譜柱上進(jìn)行分離，設(shè)置檢測器參數(shù)，由檢測器對色譜行為進(jìn)行分析并在色譜工作站中呈現(xiàn)出來高效液相色譜法如何進(jìn)行中藥制劑中活性成分的測定?案例導(dǎo)入固本咳喘片中補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的含量測定高效液相色譜儀由哪些部分組成？高壓輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱和檢測器等分別發(fā)揮了什么作用？中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法一、概述高效液相色譜法（HPLC）是一種現(xiàn)代色譜分析法，其基本方法是采用高壓輸液泵將流動相泵入到裝有填充劑的色譜柱中，注入的供試品被流動相帶入色譜柱內(nèi)進(jìn)行分離后，各組分先后進(jìn)入檢測器中檢測，最后由數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)對各數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄和處理，從而完成定性和定量分析工作隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為高效液相色譜法控制中藥及中藥制劑的質(zhì)量提供了更廣闊的前景，高效液相色譜法現(xiàn)已成為中藥及中藥制劑含量測定最常用的分析方法方法類型含量測定方法品種數(shù)儀器分析法高效液相色譜法1388氣相色譜法58薄層色譜法46紫外-可見分光光度法19化學(xué)分析法滴定分析、揮發(fā)油測定法等52中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法高效液相色譜法用于含量測定有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、加校正因子的主成分自身對照法、不加校正因子的主成分自身對照法和面積歸一化法中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法

《中國藥典》一部收載的中藥制劑的含量測定絕大多數(shù)采用的是高效液相色譜法中的外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，其中外標(biāo)法最為常用含量測定方法中藥活性成分代表中藥制劑高效液相色譜外標(biāo)法黃芩苷柴黃片、防風(fēng)通圣丸、健兒消食口服液等大黃素和大黃酚黃連上清丸、復(fù)方大青葉合劑、冰黃膚樂軟膏等綠原酸金嗓開音丸、小兒咽扁顆粒、銀翹解毒顆粒等丹皮酚六味地黃丸、桂枝茯苓膠囊、杞菊地黃丸等二、儀器組成與工作原理

1.儀器組成高效液相色譜儀一般由高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)分析處理系統(tǒng)共同組成。所用儀器應(yīng)定期檢定并符合規(guī)定中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法

2.儀器構(gòu)造與功能中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（1）高壓輸液系統(tǒng)由儲液瓶、過濾裝置、脫氣裝置、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置等組成儲液瓶由化學(xué)惰性、耐腐蝕材料制成，有無色和棕色兩種。位置一般高于高壓輸液泵，在使用過程應(yīng)密閉流動相進(jìn)入色譜柱前，先經(jīng)過過濾器，微孔濾膜將直徑大于0.45μm的固體顆粒雜質(zhì)攔截中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法高壓輸液泵是高效液相色譜儀的關(guān)鍵部件之一，用以完成流動相的輸送任務(wù)柱塞往復(fù)泵：輸送流動相高壓輸液泵耐腐蝕、耐高壓、無脈沖、輸出流量范圍寬，流速恒定，泵體易于清洗和維修高壓輸液泵可分為恒壓泵和恒流泵兩類，常使用恒流泵，即壓力隨系統(tǒng)阻力改變而流量不變。泵性能的好壞直接影響到系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（2）進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)樣系統(tǒng)的作用是將試樣引入色譜柱，要求進(jìn)樣系統(tǒng)具有使用方便、重復(fù)性好、進(jìn)樣量可變范圍大、不影響柱分離效能等特點(diǎn)常用進(jìn)樣器有高壓進(jìn)樣閥、六通進(jìn)樣閥以及自動進(jìn)樣器等裝置中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（3）色譜分離系統(tǒng)由保護(hù)柱、色譜柱、恒溫裝置和連接閥組成保護(hù)柱是裝在進(jìn)樣器與色譜柱之間的消耗性柱，具有防止供試品和進(jìn)樣閥墊圈中的固體顆粒進(jìn)入分析柱的作用。保護(hù)柱的填料與分析柱的填充劑相同，柱長為5cm左右，在分析50~100個供試品后需要更換保護(hù)柱芯中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法色譜柱是高效液相色譜儀的重要部件，由柱管、接頭和過濾片組成品牌填料C18/C8（直徑×長度，粒徑）如：AgilentZorbaxSB-C18(4.6×250mm,5μm)柱規(guī)格：一般采用直形柱管，標(biāo)準(zhǔn)填充柱柱管內(nèi)徑為1.6mm或3.9mm，長10cm~50cm，填料粒度5~10μm中藥制劑的定量分析中多使用十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS）為填充劑的色譜柱、極性溶劑為流動相的反相色譜系統(tǒng)柱填料：基本材料多為粒度5~10μm或3~5μm的全多孔球形或無定型硅膠；化學(xué)鍵合相中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（4）檢測系統(tǒng)用于檢測經(jīng)色譜柱分離后的組分濃度的變化，并由記錄儀繪出譜圖來進(jìn)行定性、定量分析通用型檢測器：蒸發(fā)光散射檢測器ELSD、示差折光檢測器選擇型檢測器：紫外檢測器UVD、熒光檢測器、電化學(xué)檢測器、質(zhì)譜檢測器中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法（5）數(shù)據(jù)分析和處理系統(tǒng)由電腦控制色譜儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理的系統(tǒng)，具有色譜峰識別、基線校正、峰解析、計算保留時間、峰高、峰面積以及定量計算組分含量的功能鏈接未來崗位中藥制劑中有效成分或特征性指標(biāo)成分含量的測定對于評價中藥質(zhì)量的優(yōu)劣具有重要意義，同時也是藥品質(zhì)量檢驗中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本講內(nèi)容既是知識體系中的重點(diǎn)內(nèi)容，也是崗位工作中的重要技能作為一名藥品檢驗人員，須牢固樹立“質(zhì)量第一、安全操作”的意識，牢固掌握高效液相色譜法測定中藥制劑含量的操作方法和注意事項，細(xì)致準(zhǔn)確的記錄檢驗結(jié)果，確保檢驗結(jié)果的真實可靠小結(jié)高效液相色譜法的原理和常用測定方法高效液相色譜儀的儀器組成高效液相色譜儀各系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能思考題為什么大多數(shù)中藥制劑都采用高效液相色譜法對其有效成分或特征性成分進(jìn)行含量測定？CONTENTDETERMINATIONTECHNOLOGYOFTRADITIONALCHINESEMEDICINEPREPARATIONS–HIGHPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYEXTERNALSTANDARDMETHOD中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜外標(biāo)法案例導(dǎo)入牛黃解毒片中黃芩苷的含量測定本品是由人工牛黃、雄黃、石膏、大黃、黃芩、桔梗、冰片和甘草加工而成的片劑采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定，本品中每片含黃芩的量以黃芩苷計算測定法分別精密吸取對照品溶液（黃芩苷對照品）5μl和供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定本品每片含黃芩以黃芩苷計，小片不得少于3.0mg，大片不得少于4.5mg案例中運(yùn)用高效液相色譜法測定了哪些參數(shù)?案例導(dǎo)入牛黃解毒片中黃芩苷的含量測定運(yùn)用外標(biāo)法如何計算每片牛黃解毒片中黃芩苷的含量？中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法一、概述高效液相色譜法的定量分析方法有外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、以及內(nèi)標(biāo)法加校正因子法等《中國藥典》一部收載的中藥制劑含量測定絕大多數(shù)采用高效液相色譜外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法，其中外標(biāo)法最為常用主要介紹外標(biāo)法的定量依據(jù)、測定方法、測定步驟以及應(yīng)用實例

1.定量依據(jù)中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法二、高效液相色譜外標(biāo)法利用色譜峰的峰面積與待測組分濃度成正比的原理，以待測組分的標(biāo)準(zhǔn)品作對照品，分別用高效液相色譜儀測得待測組分和對照品色譜峰的峰面積，從而進(jìn)行定量計算

2.測定方法中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法外標(biāo)法可分為標(biāo)準(zhǔn)曲線法（工作曲線法）、外標(biāo)一點(diǎn)法、外標(biāo)二點(diǎn)法當(dāng)供試品中待測組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過原點(diǎn)時，用一種濃度的對照品溶液，與供試品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測得峰面積或峰高的平均值，按下面公式計算供試品中待測組分的含量需要注意的是外標(biāo)法對于進(jìn)樣體積的要求非常嚴(yán)格，為控制每次進(jìn)樣的體積不發(fā)生明顯偏差，最好采用手動進(jìn)樣器定量環(huán)或自動進(jìn)樣器來操作

3.測定步驟中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法A供：供試品溶液中待測組分的峰面積C供：供試品溶液中待測組分的濃度A對：對照品溶液峰面積的平均值C對：對照品溶液的濃度對照品溶液配制一份溶液多次進(jìn)樣，測得峰面積，求出平均值供試品溶液配制配制多份進(jìn)行進(jìn)樣，測得峰面積

4.應(yīng)用實例中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相色譜法應(yīng)用實例胃舒寧顆粒中甘草酸的含量測定

（1）色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗

（2）對照品溶液的制備①填充劑：C18②流動相：乙腈-0.017mol/L磷酸鹽溶液（35：65）③檢測波長：250nm理論板數(shù)按甘草酸峰計應(yīng)不低于3000C甘草酸=97.95μg/ml中藥制劑含量測定技術(shù)——高效液相