生物技術(shù)抗體制藥培訓(xùn)課件

生物技術(shù)抗體制藥第一節(jié)概述

1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。

2生物技術(shù)抗體制藥

抗體是指能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合具有免疫功能的球蛋白。

抗體的產(chǎn)生：機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞被活化增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。3生物技術(shù)抗體制藥20世紀(jì)60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結(jié)構(gòu)類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的概念，而抗體是生物學(xué)功能的概念。4生物技術(shù)抗體制藥

多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質(zhì)，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。5生物技術(shù)抗體制藥1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產(chǎn)等特點(diǎn)，為抗體制備和應(yīng)用提供了全新的手段，還促進(jìn)了基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展。6生物技術(shù)抗體制藥

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用與疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測(cè)與某些疾病有關(guān)的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。7生物技術(shù)抗體制藥

單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對(duì)器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對(duì)腫瘤進(jìn)行定向治療。8生物技術(shù)抗體制藥第二節(jié)單克隆抗體

單克隆抗體是將抗體產(chǎn)生細(xì)胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細(xì)胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細(xì)胞成為純一的單克隆細(xì)胞系而產(chǎn)生的。9生物技術(shù)抗體制藥10生物技術(shù)抗體制藥11生物技術(shù)抗體制藥

一、抗原與動(dòng)物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當(dāng)抗原，再用抗原進(jìn)行動(dòng)物免疫。有的抗原可以用化學(xué)合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經(jīng)免疫、篩選、克隆化。12生物技術(shù)抗體制藥

為使雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定，免疫動(dòng)物和骨髓瘤細(xì)胞供體同一品系動(dòng)物進(jìn)行免疫。目前常用的骨髓瘤細(xì)胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)的品系。13生物技術(shù)抗體制藥

免疫的方法采用體內(nèi)免疫法和體外免疫法。

體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多時(shí)應(yīng)用，一般用8～12周齡雌性鼠。顆粒性抗原（如細(xì)菌細(xì)胞抗原）的免疫原性強(qiáng)，可不加佐劑，直接注入腹腔10個(gè)細(xì)胞進(jìn)行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。714生物技術(shù)抗體制藥可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與福氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內(nèi)，進(jìn)行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。一般再采脾細(xì)胞前3日由靜脈注射最后一次抗原。刺激B細(xì)胞分裂。15生物技術(shù)抗體制藥

脾內(nèi)免疫法即在麻醉下直接將

0.1～0.2ml抗原注入脾臟進(jìn)行免疫。細(xì)胞抗原需105個(gè)，可溶性抗原需10μg。

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體外免疫法用于不能采用體內(nèi)免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；免疫源性極弱，易引起免疫抑制。優(yōu)點(diǎn)：需抗源量少，免疫期短，干擾因素少。17生物技術(shù)抗體制藥

體外免疫法：用4～8周齡BALB/c

小鼠的脾臟制成單細(xì)胞懸液，再加入適當(dāng)抗原使其濃度達(dá)0.5～5μg/ml,在5%CO

37C下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞融合。o2o18生物技術(shù)抗體制藥二、細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)細(xì)胞融合的方法：脾細(xì)胞（1×10）骨髓瘤細(xì)胞（2×10）混合聚乙二醇誘導(dǎo)下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。8719生物技術(shù)抗體制藥

用于細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)具有融合率高，自身不分泌抗體，所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞分泌抗體能力強(qiáng)，長期穩(wěn)定。

PEG相對(duì)分子量4000，濃度為50%

二甲基亞砜增加融合率。20生物技術(shù)抗體制藥

細(xì)胞融合后可產(chǎn)生多種融合。脾—脾、脾—瘤、瘤—瘤融合細(xì)胞。選擇性培養(yǎng):

培養(yǎng)基為HAT培養(yǎng)液。次黃嘌呤(H)氨甲喋呤(A)胸腺嘧啶(T)配制。

A阻斷DNA合成。21生物技術(shù)抗體制藥22生物技術(shù)抗體制藥

三、篩選陽性克隆與克隆化篩選陽性克隆常用檢測(cè)方法：免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)等?？寺』侵竼蝹€(gè)細(xì)胞通過無性繁殖而獲得細(xì)胞集團(tuán)的整個(gè)培養(yǎng)過程。23生物技術(shù)抗體制藥ELISA用于破傷風(fēng)抗體的篩選24生物技術(shù)抗體制藥五、單克隆抗體的大量制備體外培養(yǎng)法可獲的10μg/ml抗體體內(nèi)誘生法可獲的5～20mg/ml抗體用BALB/c小鼠。降植烷接種雜交瘤細(xì)胞取腹水離心上清。26生物技術(shù)抗體制藥

六、單克隆抗體的純化依單抗IgG類和亞類不同，選各種不同的純化方法。體內(nèi)誘生法單克隆抗體的純化方法：1離心取上清，超濾，鹽析。2分離⑴凝膠過濾用于IgGIgM單抗純化。⑵陰離子交換層析IgG單抗純化。⑶親和層析IgG單抗純化。27生物技術(shù)抗體制藥第三節(jié)鼠源性單克隆抗體

的改造

雜交瘤單抗為鼠源性，應(yīng)用人體產(chǎn)生人抗鼠抗體及毒副作用。對(duì)鼠源性的單抗進(jìn)行基因加工和改造。目的：降低免疫源性；降低相對(duì)分子量。人-鼠嵌合抗體、改形抗體、小分子抗體。28生物技術(shù)抗體制藥29生物技術(shù)抗體制藥Ig分子結(jié)構(gòu)30生物技術(shù)抗體制藥Ig分子的基因結(jié)構(gòu)31生物技術(shù)抗體制藥一、人鼠嵌合抗體

抗原抗體結(jié)合功能—抗體可變區(qū)（V）同種性免疫源性—抗體穩(wěn)定區(qū)（C）在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉(zhuǎn)染骨髓瘤細(xì)胞，就能表達(dá)完整人-鼠嵌合抗體。32生物技術(shù)抗體制藥二、改形抗體（CDR移植抗體）Ig分子中參與構(gòu)成抗原結(jié)合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個(gè)可變區(qū)。H和L鏈各有三個(gè)CDR，其它部分稱框架區(qū)。用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性。可消除免疫源性。33生物技術(shù)抗體制藥34生物技術(shù)抗體制藥三、小分子抗體

基因工程小分子抗體僅表達(dá)鼠源單抗的V區(qū)片段，相對(duì)分子量為原抗體的1/80～1/3。即保留CDR區(qū)，而Ig分子中的C區(qū)不表達(dá)。小分子抗體類型有：①Fab片段抗體②Fv抗體③單鏈抗體35生物技術(shù)抗體制藥④單域抗體⑤最小識(shí)別單位單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)：①可去除非特異性反應(yīng)的競爭性表面蛋白，腫瘤顯象背景更加清晰性。②易滲透腫瘤組織中增加藥物治療濃度。③免疫源性小，可消除人抗鼠的排異反應(yīng)。36生物技術(shù)抗體制藥

單鏈抗體大多在大腸桿菌中表達(dá)，有三種形式：①直接在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)；②與其它菌體融合表達(dá)融合蛋白；③分泌表達(dá)具有功能的單鏈抗體。37生物技術(shù)抗體制藥四、雙功能抗體雙功能抗體就是雙特性抗體。它是一種非天然性抗體。其結(jié)合抗原的兩個(gè)臂具有