液相色譜柱的應(yīng)用課件

液相色譜柱的應(yīng)用高效液相色譜培訓(xùn)系列1目錄一、液相色譜分離原理二、液相色譜柱的結(jié)構(gòu)三、液相色譜柱的選擇四、色譜柱的使用五、分析條件的影響六、色譜柱的維護(hù)CompanyLogo2一、

HPLC分離原理樣品組分在流動相和固定相之間進(jìn)行分配，由于不同組分在流動相和固定相之間的交互作用能力(吸附.分配.離子交換.分子尺寸等)不同，使得不同組分在色譜柱上的移動速率不一樣，從而產(chǎn)生色譜分離。(必要條件)CompanyLogo3分配過程CompanyLogo4分配系數(shù)-

K

K=K=常數(shù)

（T恒定）

Cm=組分在流動相中的濃度Cs=組分在固定相中的濃度CSCmCompanyLogo5容量因子k

是指在一定條件下，組分在兩相間達(dá)到分配平衡時的質(zhì)量比。在實際工作中，常應(yīng)用另一表征色譜分配平衡過程的重要參數(shù)——容量因子(capacityfactor)，也稱分配比(partitionratio)，以k

表示。

k=Ms/MmMs為組分在固定相中的質(zhì)量，

Mm為組分在流動相中的質(zhì)量由保留時間計算出容量因子，即可由實驗測定容量因子kCompanyLogo6色譜理論：塔板理論--柱分離效能指標(biāo)CompanyLogo7色譜理論：速率理論--影響柱效的因素

速率理論是荷蘭學(xué)者范·弟姆特于1956年提出的,表述了影響柱效的因素及提高柱效的多種途徑，其核心是速率方程（也稱范·弟姆特方程式）。

速率方程

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度；u：流動相的線速度CompanyLogo8色譜理論：速率理論--影響柱效的因素H=A+B/u+C·uCompanyLogo9色譜理論：分離度分離度：兩個相鄰組分的保留值之差與其平均峰寬之比。

R=2（TR2-TR1）/（W2+W1）計算表明：1：R<0.8時，兩組分不能完全分離2：R=1時，兩組分峰重疊約2%3：R=1.5時，兩組分峰完全分離。R值越大分離越好，反之則峰重疊愈多。降低柱溫、增加柱長可使R提高。CompanyLogo10樣品組分的分離CompanyLogo11液相色譜的基本流程圖流動相

泵色譜柱檢測器

泵輸液分離

檢測

記錄AEGBCDF進(jìn)樣閥進(jìn)樣CompanyLogo12HPG-3x00RS泵在整個流速范圍下保持800bar高壓最高流速達(dá)到5ml/minWPS-3000RS自動進(jìn)樣器進(jìn)樣周期15秒進(jìn)樣閥耐壓1000barTCC-3000RS柱溫箱5-110°C溫度范圍柱后冷卻DAD-3000RS檢測器全波長掃描范圍數(shù)據(jù)采集速率100HzAcclaim?2μm色譜柱耐壓800barChromeleon?CMS軟件及時獲得結(jié)果UltiMate3000RSLC快速分離液相27/07/202313CompanyLogo13高性能－UltiMate3000x2三元梯度系統(tǒng)有六通道脫氣機(jī)的溶劑架獨特的雙梯度泵：兩個三元梯度泵封裝在一個機(jī)箱內(nèi)帶溫控選項的自動進(jìn)樣器獨特的柱溫箱可放置兩個柱切換閥可變波長或二極管矩陣紫外可見光檢測器CompanyLogo14液相色譜柱的應(yīng)用二、色譜柱的結(jié)構(gòu)和安裝CompanyLogo15色譜柱的構(gòu)造.色譜柱管常用內(nèi)壁拋光的不銹鋼管作色譜柱的柱管以獲得高柱效。使用前柱管先用氯仿、甲醇、水依次清洗，再用50%的HNO3對柱內(nèi)壁作鈍化處理。鈍化時使用HNO3在柱管內(nèi)至少滯留10min，以在內(nèi)壁形成鈍化的氧化物涂層。色譜柱規(guī)格內(nèi)徑：常用4.6mm，2.1mm

柱長：常用50，100，150，250cm

CompanyLogo16色譜柱的構(gòu)造色譜柱管由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。

柱接頭采用低死體積結(jié)構(gòu)，柱接頭兩端是螺紋組件連接，中間放置壓環(huán)用于密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。

CompanyLogo17

色譜柱子的構(gòu)造不同廠家和型號的柱子會有一定的差別CompanyLogo18液相色譜柱的構(gòu)造在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片(或濾網(wǎng))，用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失。空柱各組件均為不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內(nèi)不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

CompanyLogo19色譜柱的構(gòu)造柱填料：液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進(jìn)行的，柱子的分類是依據(jù)填料類型而定。常用顆粒粒徑在3—10μm的范圍內(nèi)。

正相柱：多以硅膠為柱填料。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH2等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán)(ODS)的非極性填料。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、-NH2、苯基等。

CompanyLogo20液相色譜柱的安裝色譜柱的安裝：

拆開柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。CompanyLogo21液相色譜柱的安裝按柱管上標(biāo)示的流動相流向，(如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱)；柱的出口與檢測器連接。連接管是外徑為1.57mm、內(nèi)徑為0.1-0.3mm的鏈接管。連接管通過空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時針擰緊空心螺釘，直到擰不動為止。如色譜柱通過流動相加壓后有漏液現(xiàn)象，請用扳手繼續(xù)順時針擰1／4圈，直至不漏液為止。CompanyLogo22連接接管必須注意：如果伸出的管線長度過長，可能漏液

螺母坡度不匹配，密封性差

死體積區(qū)如果伸出的管線長度不夠，可能產(chǎn)生死體積CompanyLogo23色譜連接注意事項1.盡量減少死體積CompanyLogo24連接管線與接頭<0.12mm內(nèi)徑管線用于毛細(xì)管HPLC中<2.1內(nèi)徑色譜柱0.17mm內(nèi)徑管線用于分析型HPLC中2.1~4.6內(nèi)徑色譜柱0.25mm內(nèi)徑管線用于半制備型HPLC中9.4內(nèi)徑色譜柱0.5mm內(nèi)徑管線用于制備型HPLC中21.2內(nèi)徑色譜柱50mL柱外體積（管線）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL柱外體積Time(min)0.00.51.01.52.04321樣品:1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素色譜柱:StableBondSB-C18,4.6x30mm,3.5mm流動相:85%H2Owith0.1%三氟乙酸:15%ACN流速:1.0mL/min溫度:35°CCompanyLogo25液相色譜柱的應(yīng)用三、液相色譜柱的選擇CompanyLogo26

分離模式的選擇樣品溶于有機(jī)溶劑溶于水溶于四氫呋喃非離子化離子化溶于有機(jī)溶劑溶于水溶于正己烷溶于甲醇或甲醇/水或乙腈或乙腈/水用鍵合相的反相模式用鍵合相的反相模式低分子凝膠滲透色譜用鍵合相的反相模式抑制電離反相鍵合相色譜用硅膠的正相模式離子交換模式凝膠滲透色譜凝膠過濾色譜大孔填料的離子交換模式用大孔填料的反相模式分子量>2000分子量<2000低分子凝膠滲透色用硅膠的正相模式用鍵合相的正相模式CompanyLogo27

1.填料：硅膠、氧化鋁、聚苯乙烯等

2.

鍵合相：

C4、C8、C18、苯基、氨基等（封端技術(shù)）3.孔徑：60-100A分子量<2000300A分子量>20004.粒徑：2um-10um5.內(nèi)徑：10mm以下（分析），10mm以上（制備）

6.長度：10、15、25、30mm

柱子的選擇CompanyLogo28正相&反相色譜正相色譜20%反相色譜80%正相色譜 極性:固定相>流動相 固定相-極性 流動相(正己烷,異丙醇)-非極性 極性物質(zhì)后出峰反相色譜極性:固定相<流動相 固定相-非極性 流動相(甲醇,水,乙腈,THF,)-極性 非極性物質(zhì)后出峰CompanyLogo29正相色譜CBACBA

C

B

A

C

B

A低極性流動相中極性流動相極性:A>B>CCompanyLogo30反向色譜法固定相（非極性）C18,C8,C4,苯基流動相(極性)Water,MeOH,MeCN,THF弱酸，弱堿溶劑極性CompanyLogo31各種反相填料的使用比例CompanyLogo32反向色譜法高極性流動相中極性流動相極性:A>B>C

A

BC

A

BCCompanyLogo33流動相1.反相色譜最常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度如下：

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃最常用的流動相組成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的毒性大，價格貴，通常優(yōu)先考慮“甲醇—H2O”流動相。2.正相色譜常用的流動相及其沖洗強(qiáng)度的順序是：

正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇最常用的是正已烷，CompanyLogo34不同混合溶劑的粘度比較CompanyLogo35柱填料基質(zhì)

硅膠基質(zhì)-pH2~8Al2O3

.nH2O-pH1~14

聚合物基質(zhì)-pH1~14高pH下,硅膠會溶解低pH下,鍵合相會斷裂化學(xué)修飾困難孔結(jié)構(gòu)復(fù)雜,孔徑不均勻，導(dǎo)致柱效不夠高,有機(jī)溶劑可能導(dǎo)致聚合物基質(zhì)溶漲而受損CompanyLogo36

色譜柱的性能參數(shù)物理性質(zhì)硅膠純度色譜柱尺寸顆粒形狀粒徑表面積孔徑鍵合類型碳覆蓋率封端化學(xué)性質(zhì)CompanyLogo37色譜柱的物理性質(zhì)硅膠純度 填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度色譜柱尺寸 色譜柱子的長度和內(nèi)徑顆粒形狀 球型或不規(guī)則型粒徑 平均顆粒直徑,通常3-10μm表面積 顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/g表示孔徑 顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300?

CompanyLogo38硅膠純度

A類硅膠由于帶負(fù)電荷的殘留硅羥基和酸性表面上金屬含量高(硅羥基的pKa低),導(dǎo)致堿性化合物發(fā)生拖尾B類硅膠(高純)由于金屬含量低,硅羥基pKa高,堿性化合物不易發(fā)生拖尾一般金屬濃度<35ppm);99.995%純度的二氧化硅CompanyLogo39

A型、B型硅膠比較

A型硅膠化合物被吸收B型硅膠峰型峰高分離正常CompanyLogo40金屬敏感測試色譜柱Diamonsil（鉆石）C185um，150x4.6mm流動相CH3CN/Water(50:50)流速1.0mL/min檢測UV@230nm硅膠中如果存在金屬雜質(zhì)，將與2,3-二羥基萘（峰2）形成金屬螯合物，保留時間延長并導(dǎo)致峰形拖尾。2,7-二羥基萘（峰1）不與金屬作用并作為內(nèi)標(biāo)物。CompanyLogo41色譜柱子的尺寸色譜柱尺寸對色譜分離的影響：?短柱(15-100mm)-運行時間短,柱壓低

?長柱(150-250mm)–運行時間長，分離度高?窄徑柱(2.1mm)-檢測器靈敏度高?寬徑柱(3-23mm)-載樣量高CompanyLogo42顆粒形狀與大小顆粒形狀：1球形

2無定形球形粒徑---對色譜分離的影響

較小的顆粒柱效較高,但會引起柱壓過高.3.5μm粒徑的常用于分離復(fù)雜的多組份樣品,而組份單一的樣品多采用5μm的粒徑1.8μm

3.5μm

5μm

7μm

10μmCompanyLogo43填料粒度

商品化的填料從2μm~30μm目前常用于分析3μm,5μm,10μm用于半制備10μm,15μm用于制備15μm~30μm

3μm

填料CompanyLogo44粒徑的影響NFlow3μm5μm10μmCompanyLogo45粒徑與柱效CompanyLogo46

核殼U-HPLC的科學(xué)原理美國AdvancedMaterialTechnologyInc.Kirkland博士發(fā)明。內(nèi)核1.7um,因此柱效至少相當(dāng)于UPLC;外層0.5um,總粒徑2.7um,因此色譜柱壓力接近3.0um色譜柱。CompanyLogo47

流速設(shè)定CompanyLogo48色譜柱尺寸和填料粒徑的影響1.C184.6*250,5um;242nm,甲醇15%→60%(45min)2.C184.6*150,3.5um;242nm,甲醇15%→60%(25min)3.C184.6*50,3.5um;242nm,甲醇15%→60%(10min)CompanyLogo49比表面積與孔徑表面積---對色譜分離的影響

高比表面積對于多組份樣品的分離具有較強(qiáng)的保留能力、柱容量和分離度.比表面積低的填料通常能迅速達(dá)到平衡狀態(tài),對于梯度淋洗尤為重要孔徑---對色譜分離的影響

大孔的填料顆?？梢匝娱L溶質(zhì)大分子在填料表面滯留的時間,達(dá)到充分分離,改善峰形樣品MW2,000,選擇100?的孔徑樣品MW>2,000,選擇300?的孔徑CompanyLogo50比表面積的比較CompanyLogo51比表面積與孔徑的影響CompanyLogo52大孔徑填料適用于大分子分析大孔徑300?全多孔色譜柱可用于分離蛋白質(zhì)和多肽

色譜柱填料孔徑必須適合待測物分子自由進(jìn)出填料孔,與孔內(nèi)表面的鍵合相進(jìn)行分離分配CompanyLogo53300?孔徑可改善蛋白質(zhì)和多肽峰形0.2000.020.040.060.080.100.120.140.160.18300C18(300?)C18(80?)PW1/2LeuEnkephalinM.W.=556AngiotensinII(血管緊張素II)M.W.=1046InsulinBM.W.=3,496CytCM.W.=12,327Rnase(核糖核酸酶)M.W.=13,684Lysozyme(溶菌酶)M.W.=13,900孔徑,分子量對峰寬的影響(梯度分離)選擇合適的填料孔徑分析大分子可獲得最佳峰形CompanyLogo54300?孔徑可改善大分子的峰形色譜柱:4.6x150mm,5mm流動相:60%MeOH:40%0.1%三氟乙酸流速:0.75mL/min溫度:RT 檢測器:UV282nm溶液中的分子尺寸決定適宜的色譜柱孔徑窄的峰寬表明待測分子進(jìn)入填料孔沒有受到阻礙SB-C3(80?)300SB-C3(300?)Pw1/2=0.442Pw1/2=0.125OONHOHOCHOHOOHOHOOOOOOOCH3CH3OCH3OCH3CH3CH2CH2CH2CH3CH3CH3H3CH3CH3C0510Time(min)0510Time(min)Tylosin(泰樂菌素)MW.926分子量雖小但體積較大的分子CompanyLogo55色譜柱化學(xué)性質(zhì)鍵合類型 ?單齒鍵合-鍵合相分子與基體單點相連 ?雙齒鍵合-鍵合相分子與基體多點相連碳覆蓋率 ?與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量封端

?鍵合步驟之后,用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來CompanyLogo56鍵合類型鍵合類型對色譜分離的影響

：

單齒鍵合：提高傳質(zhì)速率,加快色譜柱平衡雙齒鍵合：增加色譜柱穩(wěn)定性,增加色譜柱的載樣量CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOOCompanyLogo57碳載量碳載量是指固定相中碳的含量不同的鍵合相有不同的鍵合密度，并決定固定相的本質(zhì)。一般C18、C18的碳載量為10%~14%，高的可達(dá)18%~20%CompanyLogo58碳載量碳載量---對色譜分離的影響

高碳載量：保留強(qiáng)，提高分辨率,分析時間長低碳載量：保留弱，縮短運行時間CompanyLogo59碳載量CompanyLogo60封端技術(shù)封端---對色譜分離的影響

封端：減輕待測組份與硅膠表面殘留的酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象對于極性樣品和堿性樣品，未封端與經(jīng)過封端處理的色譜柱在選擇性上有明顯差異CompanyLogo61固定相鍵合二甲基硅烷

封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,

C18,

etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClRCH3(TMS)傳統(tǒng)鍵合及封端技術(shù)

CompanyLogo62三基封端技術(shù)（酰胺基）PG=極性酰胺基，R1=空間保護(hù)的異丙基，R=烷基鏈柱子穩(wěn)定性更好，壽命更長CompanyLogo63超臨界封端技術(shù)傳統(tǒng)封端：固-液回流封端，封端試劑和催化劑溶于有機(jī)溶劑中（甲苯），與鍵合相在有機(jī)溶劑沸騰溫度回流數(shù)小時至數(shù)天不等。硅膠小孔難到達(dá)。超臨界封端：封端試劑和催化劑由CO2超或亞臨界流體傳遞，封端試劑在超或亞臨界流體狀態(tài)下擴(kuò)散系數(shù)是固-液回流狀態(tài)的1000倍，能充分?jǐn)U散到硅膠表面和小孔內(nèi)部，只需要數(shù)小時就可以最大限度封閉活性硅羥基。CompanyLogo64堿滅活測試色譜柱Diamonsil（鉆石）C185um，250x4.6mm流動相CH3OH/H2O(49:51)流速1.0mL/min檢測UV@254nm如果硅膠表面已經(jīng)被完全化學(xué)改性，乙基苯胺的三個異構(gòu)體將不會與硅膠發(fā)生非極性作用力，所以不會分離并共同洗脫出來。CompanyLogo65封端技術(shù)比較CompanyLogo66保留值與pH的關(guān)系

pH變化值0.1RS變化值1.6色譜柱：C184.6X250mm,5um流動相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6溫度：500C流速：1.0mL/min.CompanyLogo67保留值與pH的關(guān)系12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色譜柱:XDB-C84.6x75mm,3.5μm流動相:44%25mM磷酸,

pH7.00:56%甲醇流速:1.0mL/min溫度:25°C檢測:UV250nm可電離的組份的分離可能會隨pH變化發(fā)生顯著變化—甚至很小的0.05–0.25個pH變化單位.樣品:ketoprofenethylparabenHydrocortisonefenoprofenpropylparabenPropranololibuprofen0.25個pHCompanyLogo68pH值對保留時間的影響堿性條件保留時間隨PH變化明顯，PH變化0.2，保留時間變化1.2min。保留時間隨PH變化不明顯酸性條件保留時間隨PH變化明顯CompanyLogo69保留值與pH的關(guān)系保留時間酸性組份中性組份堿性組份CompanyLogo70復(fù)雜組分的流動相pH選擇技巧色譜柱:Extend-C184.6x150mm,5mm流動相:30%緩沖液:70%MeOHpH7緩沖液20mMNa2HPO4pH11緩沖液20mMTEA流速:1.0mL/min

溫度:RT 檢測器:UV254nm0512,345Time(min)76C18pH71.Maleate馬來酸鹽2.Scopolamine東莨菪堿pKa7.63.PseudoEphedrine假麻黃堿pKa9.84.Doxylamine抗敏安(多西拉敏)pKa9.25.Chlorpheniramine氯苯吡胺pKa9.16.Triprol內(nèi)徑ine苯丙烯啶pKa6.57.Diphenhydramine苯海拉明pKa9.0C18pH1105101234Time(min)657高pH下,堿性成分的保留增加待測物pKa+1.5以外的流動相pH可保證方法的穩(wěn)定性CompanyLogo71液相色譜柱的應(yīng)用四、色譜柱的使用CompanyLogo72色譜柱的評價

CompanyLogo73色譜柱的評價

CompanyLogo74溶劑前處理過濾：0.45um或0.22um孔徑濾膜

目的：除去流動相和樣品溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機(jī)鹽配制的緩沖液。試劑純度：采用“HPLC”級溶劑對試樣有適宜的溶解度CompanyLogo75溶劑前處理脫氣目的：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響：

1）柱流量不準(zhǔn)

2）檢測器基線波動

返回CompanyLogo76基線問題分析CompanyLogo77液相色譜柱的使用平衡色譜柱反相色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在甲醇（乙腈）的。由于色譜柱在儲存或運輸過程中可能會干掉。硅膠柱或極性色譜柱在經(jīng)過出廠測試后是保存在正庚烷（正己烷）中的。如果需要使用含水的流動相，使用流動相之前用異丙醇過渡。CompanyLogo78液相色譜柱的使用新色譜柱的平衡方法：首先用0.3ml/min的流速將色譜柱平衡過夜，然后將流速逐步升高到1.0ml/min沖洗30分鐘，以便將色譜柱的填料充分平衡至最佳狀態(tài)，這樣可以保證色譜柱的使用壽命，并且保證在以后的使用中，獲得分析結(jié)果的重現(xiàn)性。CompanyLogo79液相色譜柱的使用日常平衡色譜柱反相色譜柱使用10~20倍柱體積的甲醇或乙腈平衡色譜柱，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線，如果您所使用的流動相中含有緩沖鹽，應(yīng)注意用90%甲醇或乙腈過渡。緩沖鹽或離子對試劑度需要較長的時間來平衡。

正相色譜柱在使用10~20倍柱體積有機(jī)溶劑后用流動相平衡直到基線平穩(wěn)。如果需要使用含水的流動相，在使用流動相之前用異丙醇過渡CompanyLogo80色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時間

4.6x50 0.5mL5min 4.6x30 0.3mL3min 4.6x150.15mL1.5min 4.6x1501.50mL15min

2.1x500.10mL5min 60sec 2.1x300.06mL3min 36sec 2.1x150.03mL1.5min18sec色譜柱尺寸柱內(nèi)體積平衡時間 流速

(mm) (Vm)1.0mL/min

色譜柱尺寸柱內(nèi)體積平衡時間流速

(mm)(Vm)0.2mL/min1.0mL/min單次樣品運行時間=分析時間+色譜柱平衡時間色譜柱平衡時間=10倍柱內(nèi)體積÷流速CompanyLogo81液相色譜柱的使用流動相流速的選擇：

因柱效是柱中流動相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳。

當(dāng)選用最佳流速時，分析時間可能延長?？刹捎酶淖兞鲃酉嗟南礈鞆?qiáng)度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。CompanyLogo82

USP允許調(diào)節(jié)的色譜條件范圍色譜柱子長度：70%色譜柱子內(nèi)徑：±25%粒徑：可減少50%流速：±50%柱溫：±10℃流動相比例：較小比例的成分±30%緩沖鹽的濃度：±10%流動相PH：±0.5檢測波長：不允許改變CompanyLogo83五、分析條件調(diào)整的影響CompanyLogo84流動相調(diào)整的基本原則（等度）（1）由強(qiáng)到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

（2）三倍規(guī)則：每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。

（3）微調(diào)比例：當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

CompanyLogo85樣品溶劑溶解強(qiáng)度的影響

樣品溶劑溶解能力強(qiáng)于流動相導(dǎo)致色譜峰峰形問題：裂分峰色譜柱:ZORBAXC18,4.6x150mm,5um流動相:82%H2O:18%ACN檢測波長:215nmA. 樣品溶劑 100%乙腈010Time(min)12B. 樣品溶劑 流動相010Time(min)12樣品:(安痛片)1.咖啡因2.水楊酰胺CompanyLogo86樣品溶劑溶解強(qiáng)度的影響0.02.04.06.08.010.012.014.016.018.020.022.1-10.00.010.020.030.040.050.060.0minmAU1-2.9572-12.1803-18.067WVL:254nm戴安Ultimate3000色譜柱：DionexacclaimC18，250*4.6mm流動相：磷酸二氫鈉6.0g，加水1000ml，加三乙胺1ml，用氫氧化鈉溶液調(diào)PH至7.0-甲醇（75：25）檢測波長：254nm流速：1.0ml/min樣品溶劑溶解能力強(qiáng)于流動相導(dǎo)致色譜峰峰形問題：峰前伸和裂分峰1.溶劑峰2.4-N-去甲基安乃近3.安乃近溶劑：100%甲醇溶劑：80%甲醇CompanyLogo87緩沖液對中性物質(zhì)的影響色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C18,4.6x75mm,3.5μm流動相:44%A:56%甲醇流速:1.0mL/min 溫度:25°C 檢測:UV250nm含緩沖液的流動相可改善保留,分離和色譜峰峰形.A=水A=水+25mM磷酸鹽緩沖液012345Time(min)1234675012341,4,6,7235Time(min)1酮2泊金乙酯3可的松4諾洛芬5泊金丙酯6普萘洛爾7布洛芬CompanyLogo88增加緩沖液濃度減少拖尾02.55.07.5Time(min)12345602.55.0Time(min)123456色譜柱: EclipseXDB-C84.6x150mm,5um流動相: 40%磷酸鹽緩沖液 60%ACN流速: 1.5mL/min.溫度: 40°CUSPTf1.621.651.631.771.831.1210mM磷酸鹽pH7.0USPTf1.411.501.331.391.361.0025mM磷酸鹽pH7.0在中等pH下,離子強(qiáng)度較高,能有效掩蔽硅羥基的二次作用減少拖尾隨緩沖鹽濃度升高，Rt降低CompanyLogo89

流動相pH值的選擇酸性分析物：pH≤pKa-2堿性分析物：pH≥pKa+2CompanyLogo90反相HPLC常用緩沖液緩沖液 pKa pH范圍磷酸鹽pK1 2.1 1.1~3.1檸檬酸鹽pK1 3.1 2.1~4.1甲酸鹽 3.8 2.8~4.8檸檬酸鹽pK2 4.7 3.7~5.7乙酸鹽 4.8 3.8~5.8檸檬酸鹽pK3 5.4 4.4~6.4磷酸鹽pK2 7.2 6.2~8.2羥甲基甲胺 8.3 7.3~9.3氨 9.2 8.2~10.2硼酸鹽 9.2 8.2~10.2甘氨酸 9.8 8.8~10.81-甲基-哌啶 10.3 9.3~11.3四氫化吡咯 10.5 9.5~11.5二乙胺 10.5 9.5~11.5三乙胺 10.7 9.7~11.7磷酸鹽pK3 12.3 11.3~13.3緩沖液的一般有效緩沖范圍為PK±1pH。

CompanyLogo91三乙胺對堿性成分峰形的影響02.55.0Time(min)12345色譜柱:XDB-C8,4.6x150mm,5mm流動相:85%25mMNa2HPO4:15%ACN流速:1.0mL/min.溫度:35°CUSPTF5%1.1.29 2.1.333.1.634.2.355.1.57NoTEA10mMTEAUSPTF5%1.1.192.1.183.1.204.1.265.1.14Time(min)0.02.55.035421樣品:1.去甲麻黃堿2.麻黃素3.苯丙胺4.

脫氧麻黃堿5.苯丁胺CompanyLogo92酸對酸性組分的峰形的影響色譜柱:ZORBAXStableBondSB-C184.6x150mm,5mm流動相:40%A:60%ACN流速:1.0mL/min.溫度:室溫樣品:異丁苯丙酸，pKa4.4pH35mMNaH2PO4Tf=1.8pH35mMNaH2PO41%乙酸pH2.50.1%三氟乙酸Tf=1.0Tf=1.09A:

乙酸和三氟乙酸均能作為酸性調(diào)節(jié)劑加至流動相中

CompanyLogo93柱容量對峰型的影響

41.4mmoverloaded4.6mmoverloaded4.6mmCompanyLogo94液相色譜柱:ZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱尺寸:4.6x250mm5μmUV:254nm