第章重組DNA技術(shù)

第十八章重組DNA技術(shù)Chapter18TechniquesofRecombinantDNA◆DNA分子體外重組技術(shù)和核苷酸序列分析技術(shù)標志了基因工程時代的誕生?！?973年，HerbertBoyer和StanleyCohen首次成功實現(xiàn)DNA分子的體外重組?！?977年，F(xiàn)rederickSanger和WalterGilbert發(fā)明了DNA測序法?！糁亟MDNA技術(shù)(recombinantDNAtechnique)：指在體外重新組合DNA分子，并使它們在適當?shù)募毎性鲋车倪z傳操作?！暨z傳工程(GeneticEngineering)：借助生物學技術(shù)，對生物遺傳物質(zhì)進行更改和/或重新組合，以改變生物的遺傳性狀或創(chuàng)造新的生物品種的遺傳學研究技術(shù)?！暨z傳工程有廣義和狹義之別，狹義遺傳工程專指重組DNA技術(shù)(即基因工程)，廣義遺傳工程包括細胞水平的遺傳操作(也稱細胞工程)和基因工程。◆克?。菏怯⑽摹癱lone

”或“cloning

的音譯，源于希臘文“Klone”，本意為無性繁殖系，即通過無性繁殖而產(chǎn)生的完全相同的子代集合體。重懼組D膨N伐A技侵術(shù)柳的凍基丸本鄉(xiāng)豐步臟驟第凍一連節(jié)重糊組D羞N鏈A技腹術(shù)竟中植的伙酶S捷e菠c秒t失i伏o肝n鐮1騎E更n增z店y恨m匪e挑s瓶i郊n拖D災(zāi)N狂A糠R券e擠c她o藍m昂b負i惰n沈a五t急i郵o譯n酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異性核苷酸序列切割DNADNA連接酶催化相鄰DNA片段的3'末端與5'末端生成磷酸二酯鍵DNA聚合酶催化合成DNA分子反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，催化合成cDNA堿性磷酸酶切除末端磷酸基末端轉(zhuǎn)移酶在3'-羥基末端進行多聚物加尾多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5'-羥基末端磷酸化，或用來標記探針重投組D惠N治A技驢術(shù)非中螞常分用舅工敲具竊酶一腎、摸限豎制欣性武核公酸草內(nèi)央切偽酶(躬r際e土s拴t登r撥i次c攻t斗i惑o教n立e癥n窩z薄y舟m蠢e持)1辜.定聯(lián)義◆限餓制衰性拘內(nèi)只切肆酶：旅又象稱律限調(diào)制至性圣核蟲酸搭內(nèi)駐切烈酶慢，薄能依識森別咳結(jié)搭合射雙鈔鏈D碗N微A分杏子縫中彼的薄特公異州序冶列感，阿并斧切為割D蝴N彩A。2.命名

◆由三個斜體字母組成：EcoRI來源菌屬名(Escherichia)的第一個字母菌的種名(coli)R來自菌株名羅馬數(shù)字(I)代表該酶被發(fā)現(xiàn)的次序5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'3漂.限蜂制權(quán)酶娛的蓮分畜類根里據(jù)娛作著用費特邪征繭可渾以口分皂為Ⅰ型羨、Ⅱ型奔和Ⅲ型出三園種突類塘型(霜1坑)三槳型歡限玻制魔酶產(chǎn)的述基限本芬特揭征◆Ⅰ型受：型具嘴有老內(nèi)晚切掏酶憤和鋤甲閃基囑化展酶顏的確雙造重計活找性季，激作何用爛需A震T費P供仙能緣瑞，訊能貼識錢別月和義結(jié)攪合蚊于判特泡定兔的D防N董A序繪列偉位落點柜，博但別隨漫機酒切次斷貸在冷識腿別躁位滋點相以棍外母的D淘N斤A序勤列聽（恨通糖常沈在竿識絹別餅位孝點冠周泄圍4時0諸0拉~著7膨0約0統(tǒng)b麗p）鬼?！簪笮徒悖夯锞邿粲谐藘?nèi)興切貴酶賓和筆甲邀基電化世酶錄的靠雙肯重鴿活記性舅，蓋作刺用喊需A鉛T興P供蛋能址，要切乖割法位芹點爐距紅離賄識齊別煎位殖點塞約2鐘5超b肅p。(耗2擊)旅Ⅱ型杠限銷制蕩性矩核霜酸課內(nèi)濾切澤酶◆只任由戶一赤條驚肽伯鏈惠組兵成看，抗不佩具座有瞞甲通基鑄修略飾召酶碰活墳性庭，不漁需雪要A菊T寒P◆識規(guī)別伴位詞點楚一暮般緊為4喜~晃6堿卸基鼓對插組勉成偵的腫特燦異努性葬序板列飽?！羟惺砀钔梁蟪隹蛇~產(chǎn)卸生雀粘醬性穩(wěn)末石端僚，鳥也瞎可拋產(chǎn)造生仆平傅頭姨末對端爺。5'突出的粘性末端5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'5'···GGATCC···3'3'···CCTAGG···5'BamHI5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'5'···GAGCTC···3'3'···CTCGAG···5'SstI3'突出末端SmaI5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'5'···CCCGGG···3'3'···GGGCCC···5'平頭末端二扣、D屑N湊A連頓接拿酶(析D紛N曲A久l爺i吳g利a飾s趁e婆s擱)◆常輩用禽的鉤連蔬接能酶宰為T帳4連梨接露酶饞，傅既演可佩以根連秀接鳥粘蜓性蓬末瀉端搭，幕也帳可銜以自連鎖接和平俊頭基末壇端兔?！魷貭薅葧呈峭懊错懯尺B日接供反農(nóng)應(yīng)慘效灑率娘的子重徒要換因毀素襯，資通里常謝在4拖~這2唇6逆℃進癢行掌連掘接廚反品應(yīng)狗。不坊同懼類禽型束的阿限謊制毫性農(nóng)內(nèi)再切稼酶偽的要切脹點炊性萌質(zhì)帆以腥及液粘地端皆之焰間同的觸退楊火第破二登節(jié)療載口體S脅e蔬c規(guī)t叫i貿(mào)o醫(yī)n掌2耍V洪e不c矛t躬o燙r腥s◆D膽N姻A載朗體蔽：鬧是運指俗具悠有細接藝受抗外幕源D耐N辭A片往段扭并驗?zāi)芤珜?dǎo)狐入日宿堡主創(chuàng)細夾胞鎖進關(guān)行縣自貸主詠復(fù)徐制千的康特控定D識N閘A分側(cè)子獲?！艨素暵V載褲體宅用客于講克層隆沾基滴因背或D匪N修A片犧段治的墻載蔥體澡?！粲脩n于歡表少達代一別個默基萄因昨則禁稱誦為析表茶達濫載昌體緩?！糨d宰體極的討特叢點：(姜1瓶)含蔽有免復(fù)挺制荷起偏始隨點(線2討)體矮積帥小(新3江)不屋能摘插雪入盼到丹基辛因泡組坑中喪，沸易致于葵分匙離獻和雕純弦化(憐4歷)含設(shè)有抱選爆擇唐性稈標爆記(胃5潮)含拋有工克刺隆顛位抽點(含5鴨)具陸有買適選當晨的答長嫌度◆表酷達您載橡體柔則蓄除秀了販上雞述辱特咳征彈外蘋，健還破應(yīng)店在史所靜要根表祥達喊的執(zhí)基閘因獄上祥游某具患有菌轉(zhuǎn)草錄迅啟禿動搏子府，嶺下幫游判有喜轉(zhuǎn)慘錄但終倉止閣子梳等邪；由很動多摘表怎達岔載捧體賞還隨具投有底核搞糖天體淘結(jié)姿合壇位沙點出。一神、刊克槐隆很載畜體1川.質(zhì)混粒瘦載爆體◆通扯常迷為晌天喂然膠質(zhì)摧粒蘋的做人叔工截改援良D昨N津A。(通1候)p姻B謀R液3鏈2宅2為副最乳早按發(fā)戶展峽的拉常村用候克溝隆爪載漆體很之湖一混，裕具綢有融如株下銹特填點席：①民帶喪有鋒一朽個筐復(fù)該制匪起突始蟲位乖點②系具順有A離m蛋pr和T票e束tr二毅個膏抗迫性慈基般因吃，威可弱插蘇入猴失栗活③訊具頓有燥較溉小就的束分翠子嶺量(血4梳.拍3差6漫k韻b拜)④可校插困入頌較梯大煮外陷源庸片的段(閱~逼6趟k撐b搭)⑤拷預(yù)貝路數(shù)湊較泡高(可巾達1貓0論0欣0陽~丙3案0謀0包0輔)質(zhì)耀粒p槐B床R杯3屑2薦2示淺意光圖(物2輔)您p命U箱C系御列特質(zhì)靜?！粲蓀燙B模R銀3衛(wèi)2些2改植建攔而陰成緩，蓋主尼要訊特綁征頁為長：①有肌復(fù)炒制倘起仿始遮位您點(埋o攔r以i，搶源繡于p畝B離R姜3囑2修2壤)②料A相m青pr基柄因(酶估切伐位淋點雁不奮再奇單刺一)③含件有L嚇a池cZ效'基網(wǎng)因④孟含制有梳多陶克堆隆餡位妥點摘區(qū)刑段◆p駛U獲C系木列皮大單多索數(shù)悉是岡成豪對住的旅，屈如p炭U津C汽8影/咬p春U腸C哲9、p掌U擊C圖1煉8咽/飼p汗U滿C縣1順9p隊U產(chǎn)C輩1相8杠/走1戒9質(zhì)釀粒半的拌基娃本賄結(jié)柳構(gòu)◆p臣U從C系魔列慢質(zhì)昨粒落的倡優(yōu)殺點：①久具態(tài)有碧更活小坑的陣分耍子蘿量肺和據(jù)更索高進的擠拷厲貝銳數(shù)②壓適雹應(yīng)失于趣組倚織慮化繭學夜篩只選松重溝組擺體(藍繼白裂斑坦實倚驗)③寇p準U屈C系染列雜提迎供亭多皮克點隆匹位昂點(封M憐C傭S堂)2．遼噬文菌澤體戚載虧體◆常劑用她于輩大勞片希段D窄N維A的看克住隆沙，券實供驗貨中靜以λ噬粉菌悶體哀、M上1棄3和述粘至?？蛔钅獮槿坛５裼?眉.人掙工參染喬色躲體◆人岔工守染痛色宜體(鋼a狗r訪t達i路f脾i花c欄i津a沖l刺c撈h捐r翅o串m運o蜻s促o俯m死e讀s桂)：獎由殊染址色見體豆的理復(fù)慎制善元剩件禮構(gòu)槐建排的起載內(nèi)體份，嘆是糾為并克漠隆郊更在大親片圾段拘的D犬N搬A而閑發(fā)榨展鍬的菜新篇型溪載芝體征?！羧讼」ぞ橙就嫔阁w求主例要包按括戀三見種：摟細寬菌刻人沸工磚染狂色們體(死B張A四C溜)、熄酵榴母歪人歐工繪染詠色件體(怎Y沸A即C都)和孕哺收乳得動階物怕人倆工芒染靈色杏體(效M奮A煮C索)◆Y仙A伸C載蹦體越的復(fù)資制縫元微件包燙括晝：處復(fù)瞎制明起紫點呼序往列(即躬自釀主劃復(fù)冬制緒序記列板，A難R悟S秀)、驗著寫絲論粒(顫c員e柳n萌t昨r亡o訴m悼e笨r括e凍,飾C們E翻N乖)和乞兩糕個姿端染粒(喘T蹤蝶E環(huán)L旬)。二盤、紙表苗達呢載信體根糖據(jù)剛表粗達次載初體巷的癥結(jié)生構(gòu)索特束點懷：原仇核雷表續(xù)達轟載范體酵淋母朽表批達門載戴體昆間蟲卵細桑胞斷表慮達搶載腔體哺病乳攏動吵物觸細皺胞到表傾達佩載猴體植禿物腥細劈燕胞圣表欠達貴載哭體潛等1績.原念核餅表宜達繞載偶體(相1傻)原舟核釀表臥達重載米體意的結(jié)往構(gòu)爸特傷點：①謹強店啟遺動族子常聚用放啟津動朝子聰：L錘a稈c啟熱動祖子結(jié)、T廚r軍p啟流動庫子弄、T這7噬菌灑體顧啟裳動萍子②刺轉(zhuǎn)劇錄絨終輝止靠子缺：T瞇7終丹止授子咱等③S身D序跌列手：拴提母供朽核擋糖排體手的襪結(jié)彼合降位淹點(袖2隨)原育核沿表燃達呢載槐體飄表孩達候特已點：①犁非蓮融憂合壯型任表瓦達產(chǎn)蛋促白②津融惑合頸型數(shù)表棉達針蛋閘白③僅分餓泌嘩型侮表墓達配蛋眉白XhoI(158)NotI(166)EagI(166)HindIII(173)SalI(179)SacI(190)EcoRI(192)BamHI(198)NheI(231)NdeI(238)NcoI(296)T7Promoter(370-386bp)T7Terminator(26-72bp)T僑7啟譜動靜子L期a引c操滔縱泥序石列r伴b顆s(烈S在D序慰列)T失7終填止鄉(xiāng)豐子M災(zāi)C踢SNcoI(CCATGG)H洗i擾s標膽簽H燭i鉛s標透簽?zāi)j(luò)血冠酶艦位部點p維E誦T既-信2詞8秒a睬-顧c頓(悄+停)克班隆齡表陸達甲區(qū)柳結(jié)泊構(gòu)換特偉征HindIIIKpnISacIBamHIBstXIEcoRIBstXINotIXhoISphIXbaI2排.酵腎母斬表斑達凡載像體◆一螞般拼為抹質(zhì)罩粒慘型緩穿版梭錘載陽體深。酵母表達載體pYES2①選支擇脂性太標裝志◆通殿常哲利梯用舍營怒養(yǎng)雜缺漁陷頃型煮突凡變助作狡為擊篩暗選竿的物標得記愈，技如框常粘用煎的職：U肌R堡A逃3、L臣E沃U描2、H揮I妖S帥3和T廣R狗P強1。②復(fù)溉制略子◆通密常獎利掛用堡啤閣酒結(jié)酵盤母2捏μ色m環(huán)況質(zhì)惰粒肺的薪復(fù)稍制階起逗始賣序經(jīng)列蒙。③常頂用有的湊啟苗動火子◆常妙用南的惕酵盤母駐基脅因取啟釣動粥子贈：婚醇哀脫稈氫懇酶宮、效磷欠酸戀甘柄油你酸掙激億酶因、3餐-磷隙酸西甘凱油乘醛版脫仔氫液酶繁、書蔗每糖走酶陪、作酸片性庸磷雄酸棵酯捉酶香和劫酵巾母自交門配道因牽子(掠M刑Fα)。(簽1蝦)酵揪母畏表濤達揭載偶體痕的搜結(jié)授構(gòu)音特基點④上玻游野活營性病序摔列◆上運游愚活田性倡序拾列區(qū)的張功貿(mào)能仔類咸似擠于系增壞強李子我，超可麗促猾進炸轉(zhuǎn)嚼錄醉。⑤終膽止彈序悲列◆可朱終菜止嚇轉(zhuǎn)華錄腦，資還痰可歲增格加m雕R煤N居A的丟數(shù)跪量破和逆蛋膛白酬質(zhì)楚表畜達潑的晚總它量慘。⑥特惕定福蛋縱白憲結(jié)飯構(gòu)錫域◆如披信姐號返肽謎序補列擴和降核考定遼位近序筒列宗等向。(壤2第)酵礙母嬌表拉達乘載直體梁的燥表脖達快形妙式①直甚接原表餐達②分咱泌屬性薪表佳達◆外搖源止蛋銜白儀質(zhì)哪表攜達襯后柏積制累潑于革酵歐母江細漠胞億質(zhì)晴中喪，魂如首人紡乙牛型頂肝椅炎位表量面排抗尖原笛的惜表角達員?！敉獍菰床ǖ爸野滓嘿|(zhì)絨表朋達嚷后獄在伙信態(tài)號烘肽秘指外導(dǎo)丹下額分圍泌露至素細蹤蝶胞輛外鳥，絞信炊號告因桂子誰通兩常惕為α因奶子碗前臥導(dǎo)寶序碑列況，I喊n仙v搭i陜t損r金o椅g誘e刪n公畜司淡的萄酵活母寸表鏡達譽載娘體p追G肺A夫P地Zα屬捎于乖此鋸種碑類堵型次。3嶺.哺絹乳教動墨物吹表倘達相載應(yīng)體◆哺稠乳僚動辯物規(guī)細壇胞型表刷達哨外鞭源移蛋軍白爆的抗優(yōu)剛勢店是可黃被貴修僵飾?！舫庞脝〉臐q哺金乳懼動菠物盡細艱胞鈴表憐達持宿目主：中燒國丈倉雞鼠甘卵標巢悔細鬼胞(校C作H島O波)猴企腎飲細刺胞(蹤蝶C葡O泛S溪)等◆哺癢乳悟動塔物伏細傲胞齡表衛(wèi)達金載車體餃一拔般圍為耽穿題梭鑒型揪載況體仔，報含繼有榴真捕核爸細叛胞贊表艙達懲相親應(yīng)恒序懂列辟，泳如I翁n揪v歲i形t挑r抽o睜g嚷e下n公播司萄開夠發(fā)樓的p燦c柳D吵N響A鍬3企.飯3搶-襯T頁O寒P割O。哺我乳惠動哄物如表預(yù)達墳載械體p壺c精D叼N譜A測3尤.礎(chǔ)1第去三遇節(jié)重促組D鼻N朵A操細作坐的丹基蚊本闖過售程S鴨e米c聲t寄i則o魄n車3惡P楊r務(wù)o毫t聯(lián)o移c糕o伯l抹s梨o連f職D聯(lián)N就A短R聯(lián)e螺c奇o冒m瞞b房誠i杜n耍a禍t鼓i更o捐nD腎N逮A重冶組瘦的銀基蓮本怒過妙程：1名.靶革基茄因D瞎N梅A片扇段甘的仔制烈備2業(yè).適奪宜系載圈體籮的想選墨擇臘和釋制別備3島.愁D姥N固A片驅(qū)段叉與獎載擔體自的患連繩接4桶.重軋組D譜N據(jù)A轉(zhuǎn)株化愿宿五主固細續(xù)胞5讓.含多有烤重訪組D仁N淹A宿兼主趙菌父的作篩旺選6案.重襖組D鍵N孟A分添子獻的轟鑒拉定基協(xié)因前組D容N爛A質(zhì)喂粒蝦載情體限制酶目傲的貿(mào)基偵因惑序窮列重乖組偉后桿含鋪有吉外坐源笛基資因期的顛載竄體D利N誓A連意接茫酶轉(zhuǎn)雄化擴倍增重匹組D駱N謝A技趣術(shù)飾的像基儀本象步牌驟一吐、慕目棋的D雪N乏A片羽段售的發(fā)制午備◆來俘源兔與浪方寄法：鐵基小因火組D浮N媽A、c向D內(nèi)N筋A(yù)、P泊C予R產(chǎn)是物佩和覺化秩學密合晝成燈的D罪N默A?！艋b因符文騎庫(耍g克e喂n母e蝕l息i栽b氏r輔a瘡r紙y眉)：豪也袖稱輩基抹因泊組或文托庫(售g談e略n磁o稠m滿e螺l撞i洪b劃r貼a廟r密y歷)，黃用儲限濟制芽酶混切辟割房誠基建因忽組D志N艘A獲井得牽成巧千遠上紗萬客的必在敵一傍定淡大如小鮮范真圍握內(nèi)生的D丹N誤A片飽段肚，離每許一麗個D攀N灶A(yù)片魯段手與噸載顛體潮分旦子費連捉接孤，皺產(chǎn)距生虜一陶個可重講組D婦N揮A分估子否的頂混壩合秋物柄，畜重煌組D府N疊A分旬子抱轉(zhuǎn)淺化振宿幸主膝菌冶后比，瘋每鋤一蠟個洪轉(zhuǎn)掠化螞細辭胞與含浮有森一高個值重密組D組N榜A分多子媽，隙這面些癥克繩隆帝的女集病合擱體轎被蜘稱接為殼基倉因理文擠庫糞?；笠蛴芙M件文甲庫棍的淋構(gòu)梳建◆c戒D諒N壓A文乘庫(披c艷D姓N伙A載l先i醬b桑r業(yè)a獄r糞y膝)：嚴提椅取五細搭胞歪總m抱R漂N裂A，重經(jīng)倡反富轉(zhuǎn)慎錄么獲毯得洋總c魂D彼N滴A，椅每腥一冠個c贈D從N協(xié)A分暢子使與席載姨體濁連恭接核產(chǎn)園生鄙了局一嗎個殖重譜組D濃N榮A分架子謙的初混計合就物利，湯再暈轉(zhuǎn)叨化練宿貪主墾菌欠，汗每驅(qū)個淘宿愚主楊菌悟細捆胞曾克乞隆幟將耍含距有造一述個c均D榴N視A重駛組終分涌子女，跌這控些餃克璃隆持的案集掃合術(shù)體濫被翅稱污為c礙D磁N劍A文亮庫留。◆若舞目煮的吉序矮列杜全抽部歲已熔知趴，翁可燦以鄭通叢過治人佛工照合愧成牢的趴方霉法槳獲肥取此靶鞋序至列憐?！粢芽芍獱€目涂的漏序嗎列遠兩催端征序周列緊時急，勇可束以賓通驕過P攔C狂R方犬法業(yè)獲辣取叼靶何序并列察。c齒D沈N東A文貴庫保的吐構(gòu)揪建二渴、謠載捷體帥的間選輛擇晝與紛準橡備◆選謹擇座原犧則歲：睡依布據(jù)皇重羞組D辯N畏A的驕目純的續(xù)，詞選法擇攏適放當盲載踢體鞋。適賺合仿的累選已擇迫標君記克隆載體表達載體細菌載體酵母載體昆蟲細胞載體哺乳動物細胞載體三女、D舒N麥A分探子品的喬體基外貪重惡組◆互侵補職性危粘訪性朵末草端者將但使究連肢接員更疑容氧易耽。限境制膨酶殃粘庭性論末潑端纖連扛接T駁-載鵝體滾粘家性韻末弊端姻連檢接平然末接端她連六接同茫聚猛物純加拒尾雖連拖接人涂工伏接飯頭按連存接B原a耕mH泥Ⅰ切鉛割靈反益應(yīng)

GGATCCCCTAGGT客4D蔥N堡A連匯接丸酶1殃5o姓CGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連限滋制龜酶跡粘童性恰末娘端狐連書接目盯錄目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目亡錄平擇末夏端筆鏈握接3嗽.同慮聚禍物召加雄尾叢連貨接在紡末裙端駁轉(zhuǎn)亭移吊酶(螞t臘e排r奶m蹲i昌n雙a睬l京t蘋r白a惱n混s書f謝e唱r撕a逐s孩e沃)的煤作遞用級下芳，耐在D鹽N近A片再段榨末腎端盲加覺上見同漏聚毀物代序腰列仁、太制真造起出傷粘蛙性均末震端團，撒再測進殺行尺粘錄端照連趙接蹈。5′3′3′5′載饑體D將N杏A5′3′3′5′目渠的野基批因限剛制押酶牙或成機推械檢剪揪切限這制掘酶

5′3′

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A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

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