制藥分離工程色譜分離過程-課件

制藥分離工程色譜分離過程11、1概述11、1、1色譜法的定義11、1、2色譜法的發(fā)展簡史11、1、3色譜法的特點11、1、1色譜法的定義色譜法chromatography是利用混合物中各組分在兩相中分配系數(shù)不同,當流動相推動樣品中的組分通過固定相時,在兩相中進行連續(xù)反復(fù)多次分配,從而形成差速移動,達到分離的方法。

11、1、2色譜法的發(fā)展史色譜法的誕生常見的分離方式如過濾、蒸餾、沉淀、結(jié)晶、離心、萃取、膜分離等在分離復(fù)雜的混合物時就顯得力不從心了。

1903年,M、C、Tswett進行了分離植物葉中各種色素的實驗。創(chuàng)立了色譜法。然而,在20多年時間里,他的新分離方法并沒有受到科學界的重視。其中一個重要原因是德國著名化學家R、Willst?tter對色譜法的排斥與不信任。Willst?tter(1915年獲諾貝爾化學獎獲得者)1913年在其名著“葉綠素的研究”中,稱色譜法是一種“離奇的方法”,認為它不適用于制備工作,在吸附過程中,試樣組分估計發(fā)生化學變化。他寫道:“色譜法只能在試樣特別少的情況下使用,好像不適合于制備目的……”Willst?tter的觀點,即過分強調(diào)制備工作,也反映出當時有機化學家的一種普遍態(tài)度。因此,茨維特的技術(shù)是超越其時代的。1930年12月,奧地利22歲研究生E、Lederer到海得堡R、Kuhn領(lǐng)導(dǎo)的化學研究所研究類胡蘿卜素。他對文獻進行了認真考察,從文獻中了解到茨維特的色譜技術(shù)。在Kuhn的指導(dǎo)下,他用碳酸鈣作吸附劑,在一小色柱中,成功地分離了-、-、-胡蘿卜素,并發(fā)表了三篇論文,公布了他們的研究成果。這標志著色譜法的復(fù)興。Karrer在1937年,Kuhn在1938年,Ruzicka在1939年相繼獲諾貝爾化學獎。從此以后,色譜法得到普遍的公認,成為最有效的分離提純手段。色譜法的發(fā)展1931年,Kuhn、Lederer用氧化鋁與碳酸鈣分離了-、-、-胡蘿卜素后才引起重視。Tswett的方法是借助于各組分在固定相中吸附能力的強弱不同而進行分離的,稱為吸咐色譜adsorptionchromatography。1935年,Adams與Holmes合成了離子交換樹脂,并用于色譜分離,從而誕生了離子交換色譜法。1941年A、J、P、Martin與R、L、M、Synge發(fā)明了分配色譜法(partitionchromatography)。1952年獲諾貝爾化學獎。ArcherJohnPorterMartinRichardLaurenceMillingtonSynge1941年Martin與Synge提出用氣體代替液體作流動相的估計性。1952年James與Martin發(fā)表了從理論到實踐比較完整的氣液色譜法gas-liquidchromatography。1957年Golay開創(chuàng)了開管柱氣相色譜法open-tubularcolumnchromatography,即毛細管柱氣相色譜法capillarycolumnchromatography。1956年VanDeemter等在前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)展了描述色譜過程的速率理論。1965年Giddings總結(jié)與發(fā)展了前人的色譜理論。

1944年R、Consden、A、H、Gorden與Martin等發(fā)展了紙色譜。1949年Macllean等在氧化鋁中加入淀粉粘合劑制作薄層板使薄層色譜法(thinlayerchromatography)得以實際應(yīng)用,1956年E、Stahl對TLC的標準化、規(guī)范化及應(yīng)用面做了大量工作并開發(fā)出薄層色譜板涂布器之后,才使TLC得到廣泛地應(yīng)用。1959年P(guān)orath與Flodin提出了凝膠色譜法(gelchromatography)。1967年P(guān)orath、Axen與Ernback成功地創(chuàng)立了親與色譜法(affinitychromatography)。20世紀60年代初,Giddings將氣-液色譜理論用于液-液色譜,同時把高壓泵與化學鍵合固定相用于液相色譜,于60年代末出現(xiàn)了高效液相色譜(HPLC)。20世紀80年代初毛細管超臨界流體色譜(SFC)得到發(fā)展,90年代未得到較廣泛的應(yīng)用。20世紀80年代初由Jorgenson等集前人經(jīng)驗而發(fā)展起來的毛細管電泳(Capillaryelectrophoresis,CE),在90年代得到廣泛的發(fā)展與應(yīng)用。同時集HPLC與CE優(yōu)點的毛細管電色譜在20世紀90年代后期受到重視。

11、1、3色譜法的特點分離效率高可選操作參數(shù)多應(yīng)用范圍廣高靈敏度的在線檢測快速分離與過程自動化操作在色譜分析中常用分配系數(shù)來描述組分對流動相與固定相的作用力的差別:

K=Cs/Cm分配系數(shù)的差異是色譜分離的根本原因。11、2色譜分離過程的基本原理分離原理固定相色譜柱及柱技術(shù)溶質(zhì)在不互溶的固定相與流動相之間進行的一種連續(xù)多次的交換過程,它借溶質(zhì)在兩相間的分配行為的差異而使不同的溶質(zhì)分離。11、2、1色譜分離原理不同組分在色譜過程中分離情況首先取決于各組分在兩相間的分配系數(shù)、吸附能力、親與力等是否有差異。分配系數(shù)的定義:K=cs/cm11、2、2固定相(色譜柱填料)定義:在色譜分離中固定不動、對樣品產(chǎn)生保留的一相。特點:既起分離作用又不移動。固定相的的選擇對樣品的分離起著重要作用,有時甚至是決定性的作用。不同類型的色譜采納不同的固定相,如氣-固色譜的固定相為各種具有吸附活性的固體吸附劑;氣-液色譜的固定相是載體表面涂漬的固定液,液相色譜中的固定相為各種鍵合型的硅膠小球,離子交換色譜中的固定相為各種離子交換劑,排阻色譜中的固定相為各種不同類型的凝膠等等。1、硅膠及其衍生的固定相2、活性炭3、離子交換樹脂4、大孔吸附樹脂5、凝膠6、手性固定相11、3色譜分離的分類

按分離機理不同分類

按固定相及流動相的狀態(tài)分類按固定相形狀分類其他分類方法

11、3、1按分離機理不同分類吸附色譜Adsorptionchromatography,AC是指混合物隨流動相通過固定相(吸附劑)時,由于固定相對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物分離的方法。吸附作用力能夠是物理吸附作用,也能夠是化學吸附作用。物理吸附的特點是選擇性低,吸附速度較快,吸附過程可逆;化學吸附的特點是有一定選擇性,吸附速度較慢,不易解吸。物理吸附與化學吸附能夠同時發(fā)生,在一定條件下也能夠互相轉(zhuǎn)化。吸附色譜是各種色譜分離技術(shù)中應(yīng)用最早的一類,傳統(tǒng)的吸附色譜以各種無機材料為吸附劑。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的吸附色譜技術(shù),如疏水作用色譜(hydrophobicinteractionchromatography,HIC)、金屬螯合作用色譜(metalchelationchromatography,MCC)與共價作用色譜(covalentinteractionchromatography,CIC)等,所用吸附劑一般為有機基質(zhì)并通過化學修飾后制成,它們都有比較明確的作用機理,即疏水作用、螯合作用與共價作用。離子交換色譜離子交換色譜(ionexchangechromatography,IEC)是基于離子交換原理進行的色譜分離。廣泛用于生物大分子的分離純化中。親與色譜親與色譜(affinitychromatography,AFC)是將與目的產(chǎn)物具有特異親與力的生物分子固定化后作為固定相從混合物中分離目的產(chǎn)物的過程。親與作用是特別的吸附作用。分配色譜Distributionchromatography,DC又稱為液液色譜,其原理是利用混合物中各物質(zhì)在兩液相中的分配系數(shù)不同而分離。分配色譜可分為正相色譜(normalphasechromatography,NPC)與反相色譜(reversedphasechromatography,RPC)。離子對色譜ion-pair

chromatography。凝膠色譜凝膠色譜(gelchromatography,GC)以凝膠為固定相,是一種依照各物質(zhì)分子大小不同而進行分離的色譜技術(shù),因而又稱為分子篩色譜(molecularsievechromatography,MSC);空間排阻色譜(sizeexclusionchromatography,SEC)。凝膠色譜分為兩大類:凝膠過濾色譜(gelfiltrationchromatography,GFC)與凝膠滲透色譜(gelpermeationchromatography,GPC)。電色譜電色譜(electrochromatography)是電泳與液相色譜的融合技術(shù)。所謂電色譜是采納電滲流來推動流動相,使得峰擴展只與溶質(zhì)擴散系數(shù)有關(guān),因而使電色譜的理論塔板數(shù)遠遠高于液相色譜。同時由于引入了高效液相色譜的固定相,使電色譜具備了高效液相色譜固定相所具有的選擇性,使它不僅能分離帶電物質(zhì)。也能分離中性化合物。11、3、2按固定相及流動相的狀態(tài)分類氣相色譜GC(氣體為移動相,液體或固體為固定相的色譜)氣相色譜(gaschromatography,GC)僅限于能夠氣化的物質(zhì),且主要用于分析。氣相色譜包括氣液色譜GLC、氣固色譜GSC。

液相色譜LC(液體為移動相,液體或固體為固定相的色譜)液相色譜(liquidphasechromatography,LPC)可分為液液色譜LLC、液固色譜LSC。超臨界流體色譜超臨界流體色譜(supercriticalfluidchromatography,SFC)是20世紀80年代中期發(fā)展起來的一種新的色譜分離技術(shù),其流動相為超臨界流體。11、4色譜分離的基本理論11、4、1有關(guān)概念11、4、2色譜理論模型11、4、1

塔板理論塔板理論PlateTheory就是把分配色譜柱比作一個精餾塔,沿用精餾塔中塔板的概念來描述組分在兩相間的分配行為,揮發(fā)度大的組分最先從“塔頂”(即柱出口)逸出,由于流動相連續(xù)地進入柱內(nèi),為了便于研究組分在兩相間的分配行為。塔板理論的基本假設(shè):①柱由完全相同的不連續(xù)的體積單元組成,每一個體積單元猶如精餾塔中的一塊塔板,而它在柱內(nèi)又是不存在的,故稱理論塔板。②每一塊塔板的一部分空間為固定相所占據(jù),另一部分空間為流動相所占據(jù)。這后一部分空間稱為塔板體積(Vm)。流動相從柱入口以一個個Vm體積,脈沖式地加入。③組分在每塊塔板上的兩相間瞬時達到平衡。④分配系數(shù)在所有塔板上都為常數(shù),與組分濃度無關(guān)即相當于線性等溫線的情況。⑤忽略塔板間的縱向分子擴散。

進流動相平衡K=11/42/41/41/83/83/81/81/21/16?3/8?1/16(一)塔板理論優(yōu)缺點成功處:解釋了色譜流出曲線的形狀與濃度極大值對應(yīng)的tR

闡明了保留值與K的關(guān)系評價柱效(n,σ)存在問題:1)做出了四個與實際不相符的假設(shè)忽略了組分在兩相中傳質(zhì)與擴散的動力學過程2)只定性給出塔板高度的概念,卻無法解釋板高的影響因素3)排除了一個重要參數(shù)——流動相的線速度u,因而無法解釋柱效與流速關(guān)系更無法提出降低板高的途徑11、4、2速率理論RateTheory塔板理論滿意地解釋了色譜流出曲線呈高斯分布;論證了組分的保留值與分配系數(shù)間的關(guān)系;并能成功地用于塔板數(shù)的計算。塔板理論的局限性塔板理論作了五個不符合實際的假設(shè)。它還排除了一個極其重要的參數(shù)——流動相速度,并忽略了兩相體積的大小。由于排除了流動相速度這一參數(shù),因而不能解釋在不同流動相速度時的柱效不同的原因。從本質(zhì)上說,塔板理論的缺點在于忽視了組分分子在兩相中擴散與傳質(zhì)的動力學過程。(二)VanDeemteer方程式吸收了塔板理論的有效成果——H,并從動力學角度較好地解釋了影響柱效的因素渦流擴散項縱向擴散項傳質(zhì)阻抗項色譜過程中的擴散與傳質(zhì)對速率理論作出全面解釋的是荷蘭化學家VanDeemter等,以后又由美國化學家J、CalvinGiddings作了進一步的改進。當組分的譜帶向柱出口遷移時,在非理想線性色譜狀態(tài)下必定要展寬。在柱內(nèi)有四種受動力學控制的過程,使譜帶偏離理想狀態(tài)而展寬。這四種過程是渦流擴散、縱向分子擴散、流動相中傳質(zhì)與固定相中傳質(zhì)。渦流擴散eddydiffusion當組分隨流動相向柱出口遷移時,流動相由于受到固定相顆粒的障礙,不斷改變方向,使組分分子在前進中形成紊亂的類似“渦流”的流動,導(dǎo)致譜帶展寬,故稱渦流擴散。由渦流擴散引起的展寬程度可表示為:

2e=2dpL為填充不規(guī)則因子,它決定于固定相顆粒的直徑dp、粒度范圍與填充情況;L為柱長。渦流擴散項(多徑擴散項):A

產(chǎn)生原因:載氣攜樣品進柱,遇到來自固定相顆粒的阻力→路徑不同→渦流擴散影響因素:固體顆粒越小,填充越實,A項越小討論:

注:顆粒太小,柱壓過高且不易填充均勻填充柱——60~100目空心毛細管柱(0、1~0、5mm),A=0,n理較高圖示縱向分子擴散longitudinaldiffusion縱向分子擴散指沿x軸方向的擴散,它是由濃度梯度造成的。由縱向分子擴散引起的展寬程度可表示為:2l=2DmL/u為彎曲因子,亦稱阻礙因子,它反映固定相顆粒的幾何形狀對自由分子擴散的阻礙情況,一般小于1;u為流動相線速;Dm為組分在流動相中的擴散系數(shù)。Dm1/√M。同一組分在氫氣中的擴散系數(shù)要大于在氮氣中的擴散系數(shù),因此用氫氣作流動相對,縱向分子擴散更嚴重?？v向擴散項(分子擴散項):B/u產(chǎn)生原因:峰在固定相中被流動相推動向前、展開→兩邊濃度差影響因素:討論:

注:為降低縱向擴散,宜選用分子量較大的載氣、控制較高線速度與較低的柱溫選擇載氣原則:兼顧分析時間與減小縱向擴散

u較小時,選M較大的N2氣(粘度大)

u較大時,選M較小的H2氣,He氣(粘度小)

傳質(zhì)阻抗項:C·u產(chǎn)生原因:樣品在氣液兩相分配,樣品未及溶解就被帶走,從而造成峰擴張影響因素:討論:

注:固定液應(yīng)完全覆蓋載體表面,不能夠太薄,否則柱子壽命短,k太小;

T不能夠超過固定液最佳使用溫度小結(jié):范氏方程說明了在色譜分離條件的選擇中,填充均勻程度、填充物的粒度、流動相的種類及流速、固定相的液膜厚度等對柱效與峰展寬的影響氣相色譜及其應(yīng)用氣相色譜法:以氣體為流動相的柱色譜分離技術(shù)一、GC分類

1.按固定相分氣-固色譜氣-液色譜

2.按分離原理分吸附色譜分配色譜

3.按柱子粗細分填充柱色譜毛細管柱色譜氣相色譜及其應(yīng)用二、氣相色譜儀的組成

載氣→減壓→凈化→穩(wěn)壓→

→色譜柱→檢測器→記錄儀

進樣

載氣系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)記錄系統(tǒng)三、氣相色譜法的特點與應(yīng)用

占有機物20%

適于分析氣體、易揮發(fā)的液體及固體不適合分析不易氣化或不穩(wěn)定性物質(zhì)樣品的衍生化使應(yīng)用范圍進一步擴大氣相色譜柱色譜柱組成柱管填充劑填充柱：2~4米柱長，2~6mm內(nèi)徑毛細管柱：幾十米~幾百米柱長

0.1~0.5mm內(nèi)徑固體吸附劑——氣-固吸附色譜柱載體+固定液——氣-液分配色譜柱氣相色譜柱檢測器檢測器:是將流出色譜柱的被測組分的濃度轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置一、氣相色譜檢測器分類:按檢測原理分濃度型檢測器:測量組分濃度的變化響應(yīng)值與組分的濃度成正比(TCD)

質(zhì)量型檢測器:測量組分質(zhì)量流速的變化響應(yīng)值與單位時間進入檢測器的組分質(zhì)量成正比(FID)二、常用檢測器的特點與檢測原理(一)熱導(dǎo)檢測器(TCD)(二)氫焰檢測器(FID)操作條件選擇與注意事項1)載氣的選擇:載氣——N2氣燃氣——H2氣助燃氣——空氣2)使用溫度:高于柱溫50~1000C3)注意問題:質(zhì)量型檢測器,h∝u,以h定量,應(yīng)保持u恒定(峰高定量依據(jù))定性定量分析一、定性分析二、定量分析一、定性分析1、利用保留值定性

1)已知對比物定性:定性專屬性差注:不同組分如在某一色譜條件下保留值相同,應(yīng)更改色譜柱再檢測,粗步推就是否為一個純物質(zhì)峰2)相對保留值定性3)利用保留指數(shù)定性:唯一可靠、準確、重復(fù)性好2、利用化學反應(yīng)定性:收集柱后組分,官能團反應(yīng)定性鑒別(非在線)3、利用兩譜聯(lián)用定性:GC-MS,GC-FTIR定量分析:以峰高或峰面積定量(一)峰面積的測量(二)定量校正因子(三)定量方法(三)定量方法1、歸一化法2、外標法3、內(nèi)標法比較氣相色譜的應(yīng)用1、藥品中殘留溶劑的直截了當測定2、食品中風味物質(zhì)的分析3、家居物品中醛與酮的測定1,液相色譜分析法的發(fā)展2,高效液相色譜的特點3,高效液相色譜儀簡介4,液相色譜法介紹5,分析方法的選擇6,實際分析操作過程高效液相色譜(HPLC)89與經(jīng)典液相色譜法相比

顆粒極細(一般為10m以下)、規(guī)則均勻的固定相,(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小,柱效高,分離效率高;高壓輸液泵輸送流動相,流速快,分析速度快;高靈敏度檢測器,靈敏度大大提高。紫外檢測器最小檢測限可達109g,而熒光檢測器最小檢測限可達1012g。

2HPLC的特點

項目高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱:柱長/cm

柱內(nèi)徑/mm10～252～1010～20010～50固定相粒徑/μm5～5075～600色譜柱柱效(理論塔板數(shù))2×103～5×1042～50柱壓降/MPa5～150、001～0、3進樣量/g10-6～10-20、1～10分析時間/h0、05～1、01～202HPLC的特點91與氣相色譜法相比不受試樣的揮發(fā)性與熱穩(wěn)定性的限制,應(yīng)用范圍廣;可選用各種溶劑作為流動相,對分離的選擇性有特別大作用,選擇性高;一般在室溫條件下進行分離,不需要高柱溫。

HPLC的特點(二)項目高效液相色譜法氣相色譜法進樣方式樣品制成溶液樣品需氣化或裂解流動相溶液惰性氣體分離原理吸附、分配、篩析、親與等吸附與分配檢測器UVD、PDAD、RID等TCD、FID、ECD等應(yīng)用范圍低、中、高沸點有機化合物離子型無機化合物熱不穩(wěn)定化合物生物活性分子低沸點有機化合物永久性氣體93高效液相色譜儀組成輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)

3、1

高效液相色譜儀構(gòu)造檢測器簡介(一)◆紫外吸收檢測器(UVD)原理:用特定波長的紫外光照射樣品池,通過檢測透光率的變化來測定樣品濃度的檢測器。它具有波長固定,波長可變與光二極管陣列三種類型。特點:選擇性檢測器、對流量與溫度敏感性低、靈敏度較高(10-9g)?！粽酃庵笖?shù)檢測器(RID)原理: