實(shí)驗(yàn)一外周血淋巴細(xì)胞的分離課件

實(shí)驗(yàn)一

外周血淋巴細(xì)胞的分離

PBMC:peripherialbloodmononuclearcell(Tcell,Bcellandmonocyte)原理外周血各種血細(xì)胞的密度不盡相同，利用淋巴細(xì)胞分層液（Ficoll）作密度梯度離心，使一定比重的細(xì)胞群按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離。

原理外周血紅細(xì)胞粒細(xì)胞單個核細(xì)胞血小板淋巴細(xì)胞單核細(xì)胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.001

(PBMC)1.0921500rpm,20℃,30minPBMC紅細(xì)胞粒細(xì)胞Ficoll稀釋外周血Ficoll稀釋的血漿、血小板實(shí)驗(yàn)步驟1.采血，稀釋（外周血：稀釋液=1：2）2.在離心管中加入Ficoll，沿傾斜的管壁緩緩加入稀釋的外周血（Ficoll：稀釋血=1：2）實(shí)驗(yàn)步驟3.18℃，1500r/min，離心30min4.

輕輕吸取PBMC層移入另一試管中5.加足量稀釋液充分洗滌，1800r/min離心5min，棄上清。注意事項(xiàng)每毫升外周血液大約可獲1×106單個核細(xì)胞Ficoll應(yīng)適量，外周血應(yīng)充分稀釋溫度直接影響到Ficoll的比重和分離效果在Ficoll上加入稀釋外周血時(shí)，應(yīng)緩慢加，以免沖散界面吸取單個核細(xì)胞層時(shí)，應(yīng)避免吸出過多的上清液或分層液而導(dǎo)致血小板污染細(xì)胞計(jì)數(shù)1、準(zhǔn)備計(jì)數(shù)板：2、制備細(xì)胞懸液：收集細(xì)胞，制成單個細(xì)胞懸液3、加樣：用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液，4、計(jì)數(shù)：在顯微鏡下，用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格中的細(xì)胞數(shù)

實(shí)驗(yàn)步驟5、計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/毫升=（4大格細(xì)胞數(shù)之和/4）×104

注意事項(xiàng)1.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液2.加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡3.細(xì)胞壓中線時(shí)，數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右4.本法要求細(xì)胞密度不低于104細(xì)胞/ml5.鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，細(xì)胞數(shù)過少或過多，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)Enzyme-linkedimmunoabsobantassays(ELISA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)原理:antigen+antibody必需條件:

specificityvisibility

Ag-Abcomplex使用抗體的診斷檢測技術(shù)目的原理

本法是指用酶標(biāo)記抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，從而將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物高效催化作用結(jié)合起來，根據(jù)酶作用底物后顯色，以顏色變化判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測定儀作定量分析，靈敏度可達(dá)微微克（pg）水平。常用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）和堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AP），它們與抗體結(jié)合不影響抗體活性，這些酶具有一定的穩(wěn)定性，制成酶標(biāo)抗體可保存較長時(shí)間。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA），簡稱酶標(biāo)法，是根據(jù)酶免疫測定原理發(fā)展的一種技術(shù)?；镜姆椒ㄓ腥悾撮g接法、雙抗夾心法和抗原競爭法。Enzyme-linkedimmunoabsobantassays雙抗夾心法1stAbsubstratesColoredproductsEnzyme2ndAbAg1stAbcaptureantibodylabeled/detectiveAb實(shí)驗(yàn)步驟1.

包被：取羊抗鼠IgG包被單抗20ug,用0.01MTris-HCl稀釋至10ml,加入96孔板中,每孔100ul,4℃過夜；2.

封閉：用洗滌液(含0.01%Tween-20的0.01MPBS)洗滌兩次,然后加入封閉液(含15%小牛血清的0.01MPBS),每孔300ul,37℃,孵育2h；3.加樣品：洗滌兩次,加入標(biāo)準(zhǔn)品鼠IgG1ug/ml,每孔100ul,37℃,孵育2h；4.加羊抗鼠IgG-Fc-HRP:

洗滌兩次,加羊抗鼠IgG-Fc-HRP每孔100ul(5ug/ml),37℃孵育1h；5.

加底物顯色：洗滌兩次，加底物OPD反應(yīng)液每孔100ul，置于室溫5－10min；6.終止：加終止液2MH2SO450ul每孔；7.檢測及繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：于490nm處檢測OD值，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率：b＝ΣXY/ΣX2,標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝b·X(其中，X：濃度（標(biāo)準(zhǔn)品）；Y：比色OD值的均值)。８.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，通過各孔的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上相應(yīng)位置計(jì)算出相應(yīng)濃度實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、熟悉酶聯(lián)免疫檢測手段的原理。2、掌握雙抗夾心ELISA的試驗(yàn)操作。

B淋巴細(xì)胞雜交實(shí)驗(yàn)四

雜交瘤的目的

---制備單克隆抗體

雜交瘤技術(shù)的基本原理具有分泌抗體功能的B細(xì)胞難以在體外長期存活。利用細(xì)胞融合技術(shù)，將免疫后的B細(xì)胞與在體外能長期存活的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，經(jīng)過選擇培養(yǎng)獲取雜交細(xì)胞，這種細(xì)胞稱為雜交瘤細(xì)胞.（Hybridoma）該細(xì)胞的特點(diǎn)：

選擇動物Themouseisusuallytheanimalofchoice.Suitablemousemyelomacelllinesarewidelyavailable,andgrownofhybridomasinmiceisusuallynoproblem.Allofthecurrentlyavailablemousemyelomalines,whicharesuitableforfusion,areofBALB/Corigin,6-8week,femalemouseisusuallyused.1wk抗原50μg/只，溶于300μl生理鹽水中，加入等量福氏完全佐劑（CFA）充分乳化，分頸、部皮下多點(diǎn)及腹腔注射；3wk抗原的劑量及注射的部位同上，僅將全佐改為半佐（IFA）；5wk抗原50μg/只，溶于300μl生理鹽水中，腹腔注射；加強(qiáng)融合前3~5天，抗原20~30μg/只，溶于50μl生理鹽水中

小鼠尾靜脈注射以加強(qiáng)免疫（抗原沖擊）動物免疫一、可溶性抗原1wk細(xì)胞數(shù)量8×106/只，洗滌三遍，用0.3~0.4ml的生理鹽水重懸，腹腔注射；3wk細(xì)胞數(shù)量6×106/只，細(xì)胞的預(yù)處理及注射的部位同上；5wk細(xì)胞數(shù)量5×106/只，細(xì)胞的預(yù)處理及注射的部位同上；加強(qiáng)融合前的4~5天，細(xì)胞數(shù)量3×106/只，加強(qiáng)免疫

在以腫瘤細(xì)胞作免疫原時(shí)，為避免免疫過程中小鼠因生長腫瘤而死亡，故用絲裂霉素（MMC）處理免疫原細(xì)胞，抑制其生長繁殖以防形成腫瘤。最后的加強(qiáng)免疫，腫瘤細(xì)胞可不經(jīng)MMC處理。

二、細(xì)胞抗原動物免疫PEG：親水性，使細(xì)胞表面極性降低，導(dǎo)致脂質(zhì)雙分子層不穩(wěn)定，引起細(xì)胞融合。分子量：1500-2000

融合劑

HAT:次黃嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶（thymidine,T）細(xì)胞的DNA生物合成有兩條途徑：HAT選擇性培養(yǎng)TKH、THGPRT脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后的細(xì)胞類型未發(fā)生融合骨髓瘤細(xì)胞及其同核融合體：其DNA合成的主要途徑被A阻斷后，由于缺乏HGPRT而不能利用培養(yǎng)液中的H，雖TK可利用T，但不能完成完整的DNA合成過程；未發(fā)生融合的脾細(xì)胞及其同核融合體：培養(yǎng)液中不能長期生長，7天左右即死亡脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的異核融合體：即雜交瘤細(xì)胞，既從脾細(xì)胞獲得了HGPRT和TK，從而利用培養(yǎng)液中的H和T合成DNA，又從骨髓瘤細(xì)胞獲得了無限增殖的能力，因此能在HAT選擇培養(yǎng)液中生存下來。處死小鼠，固定于解剖架上打開腹腔，取出脾臟。置于120目的鋼絲網(wǎng)中，將網(wǎng)移入盛有20ml生理鹽水的平皿中，用注射針芯輕輕壓磨，使其成為單個細(xì)胞懸液，吸取1ml細(xì)胞懸液（約5×106細(xì)胞）,與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0（5×105細(xì)胞）混合，離心后棄上清骨髓瘤細(xì)胞:脾細(xì)胞為1:10一個脾臟可獲約108個細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟：免疫脾細(xì)胞的制備

1、取PEG溶液1.0ml緩慢加入混合細(xì)胞中,邊加邊攪拌；2、靜止1分鐘；3、加HAT培養(yǎng)基4ml；4、取融合細(xì)胞懸液1ml,滴加在96孔培養(yǎng)板中，每孔1滴（約50μl）；5、顯微鏡下觀察融合細(xì)胞的狀態(tài)實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

1、了解細(xì)胞雜交及單抗制備的基本原理；

2、掌握細(xì)胞融合的基本操作?！?/p>

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)小鼠放入垃圾袋，使用過的剪刀、鑷子、試管及培養(yǎng)板等沖洗干凈，放回原處，謝謝合作！

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)2-----免疫熒光技術(shù)

原理:antigen+antibody必需條件:

specificityvisibility

Ag-Abcomplex使用抗體的診斷檢測技術(shù)一、原理免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescencetechnique）-------將抗體（或抗原）經(jīng)熒光素標(biāo)記，然后再與相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合，在一定波長光波的照射下，被標(biāo)記的熒光素放出可見光（稱為熒光），借助熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可對待測抗體或抗原進(jìn)行定性和定量分析。

目前用于免疫熒光分析的熒光素異硫氫酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,FITC)；藻紅蛋白（R-PE）由于這些熒光素經(jīng)激發(fā)光照射后可發(fā)射出不同波長的熒光，因而可對細(xì)胞的一種或多種蛋白進(jìn)行示蹤。免疫熒光技術(shù)主要用于分析的標(biāo)本有：外周血新鮮細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞、組織切片等

二、

用于抗原分析的免疫熒光法

1、直接法----將熒光素標(biāo)記在單抗后直接對抗原進(jìn)行分析的方法；

第一抗體激發(fā)檢測相應(yīng)抗原2、間接法----將熒光素標(biāo)記在第二抗體

(抗抗體，通常為抗鼠Ig)的分析方法。第一抗體（鼠抗人）第二抗體（羊抗鼠）特異性高、敏感性低特異性低敏感性高直接免疫熒光染色1.取分離好的待測細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106/50l每管；2.再加10lFIT