酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)技術(shù)簡(jiǎn)介酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay），簡(jiǎn)稱ELISA,是實(shí)驗(yàn)室最常用的檢測(cè)方法。酶是能夠催化化學(xué)反應(yīng)的特殊蛋白質(zhì)，其催化效力超過(guò)目前所有人造催化劑°ELISA是將酶催化的放大作用與特異性抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來(lái)的一種微量分析技術(shù)。酶標(biāo)記抗原或抗體以后，既不影響抗原抗體反應(yīng)的特異性，也不改變酶本身的活性。因此ELISA具有準(zhǔn)確性高、檢測(cè)時(shí)間短、價(jià)格低廉、判斷結(jié)果有客觀標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果便于記錄和保存等優(yōu)點(diǎn)，適合于大批標(biāo)本的檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)、醫(yī)療檢測(cè)以及免疫實(shí)驗(yàn)分析等領(lǐng)域。核心原理：ELISA必須遵守以下3個(gè)核心原理：1）抗原或抗體能吸附于固相載體表面，并保持其免疫學(xué)活性；2）抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；3）酶結(jié)合物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，可根據(jù)已知濃度的抗原或抗體的顏色反應(yīng)的深淺繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并依此計(jì)算出未知樣品中抗體或抗原的濃度。在ELISA中酶起到很關(guān)鍵的作用，常用于ELISA法的酶有辣根過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酯酶等，其中尤以辣根過(guò)氧化物酶為多。酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原，半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還能催化酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。應(yīng)用方向:ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)大，原則上ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。在實(shí)際應(yīng)用方面可用于疾病的臨床診斷、疾病監(jiān)察、疾病普查、法醫(yī)檢查、獸醫(yī)及農(nóng)業(yè)上的植物病害的診斷檢定等。因此，它和生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、藥理學(xué)、流行病學(xué)及傳染病學(xué)等方面密切相關(guān)。按照待測(cè)物性質(zhì)的不同，ELISA反應(yīng)可以分為抗原檢測(cè)反應(yīng)及抗體檢測(cè)反應(yīng)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上，能夠進(jìn)行檢測(cè)的抗原包括：內(nèi)分泌方面的雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，血液學(xué)方面的凝固因子（如第訓(xùn)凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（HaptoGlobin）等，腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA），此外還有霍亂弧菌、大腸肝菌、綠膿桿菌和破傷風(fēng)梭菌毒素；腦膜炎球菌及淋球菌抗原；檢測(cè)免疫抑制病人中常見(jiàn)的白色念殊菌抗原，檢測(cè)病人或病獸的糞便中的輪狀病毒；檢測(cè)甲肝病毒、皰疹病毒、麻疹病毒、流感、呼吸道融合及巨細(xì)胞病毒等。而用ELISA檢測(cè)抗體，已獲得對(duì)多種傳染病和寄生蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷，亦開(kāi)始廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。在寄生蟲(chóng)病方面，它用于對(duì)瘧原蟲(chóng)、阿米巴、利日曼原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、囊蟲(chóng)、弓漿蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)、血絲蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)病等血清學(xué)診斷，這對(duì)人醫(yī)和獸醫(yī)都很重要。在病原微生物方面已用于檢測(cè)鏈球菌、沙門(mén)氏菌、布氏桿菌、結(jié)核桿菌、麻瘋桿菌、霍亂弧菌、淋球菌、假絲酵母菌等的抗體，還可用于破傷風(fēng)抗毒素和霍亂弧菌抗毒素的測(cè)定以及檢測(cè)斑疹傷寒立克次氏體感染后的抗體作診斷，也可用于對(duì)立克次氏體的種屬鑒別，還有用于檢測(cè)鸚鵡熱衣原體抗體的報(bào)導(dǎo)。ELISA也可應(yīng)用于以下病毒抗體檢測(cè)：流感病毒、腮腺炎病毒、麻診、風(fēng)疹、輪狀病毒、皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒、腺病毒、腸道病毒、腦炎病毒、黃熱病毒、狂犬病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等，其敏感性都超過(guò)目前常用的檢測(cè)方法。此外，還可用于鑒定病毒型別，例如皰疹病毒。在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測(cè)定以及對(duì)過(guò)敏的診斷，例如檢測(cè)各種過(guò)敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等。在衛(wèi)生學(xué)方面，可用于檢測(cè)食品中葡萄球菌腸毒素及沙門(mén)氏菌毒素等等。雙抗體夾心法檢測(cè)抗原雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，但要注意的是在一步法（待測(cè)抗原與酶標(biāo)抗體一起加入反應(yīng)）測(cè)定中，當(dāng)標(biāo)本中受檢抗原的含量很高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成“夾心復(fù)合物”出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)，甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此在使用一步法試劑測(cè)定標(biāo)本中含量可異常增高的物質(zhì)（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時(shí)，應(yīng)注意可測(cè)范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應(yīng)。雙抗體夾心法測(cè)抗原的另一注意點(diǎn)是類風(fēng)濕因子（RF）的干擾°RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動(dòng)物IgG的Fc段結(jié)合。用作雙抗體夾心法檢測(cè)的血清標(biāo)本中如含有RF，它可充當(dāng)抗原成份，同時(shí)與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，表現(xiàn)出假陽(yáng)性反應(yīng)。雙抗體夾心法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，但不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。雙抗體夾心法的簡(jiǎn)要操作步驟為：1）先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面;3） 加酶標(biāo)抗抗體（第二種動(dòng)物抗抗原的酶標(biāo)抗體）；4） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗原的量成正比。競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗原:當(dāng)小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的抗體結(jié)合位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。方法的基本原理可見(jiàn)圖2,經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，而另一組只加酶標(biāo)記抗原，再經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的未知抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。競(jìng)爭(zhēng)法的簡(jiǎn)要操作步驟：1） 先加入抗體，使抗體固定結(jié)合于載體表面；2） 加入梯度濃度比例的待測(cè)樣品與酶標(biāo)抗原混合物，同時(shí)做只加酶標(biāo)抗原的對(duì)照組；3） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的顯色差異，計(jì)算未知抗原的量。雙抗原夾心法檢測(cè)抗體:雙抗原夾心法的反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。雙抗原夾心法的簡(jiǎn)要操作步驟為：1） 先加入抗原，使抗體固定結(jié)合于載體表面；2） 再加樣品，使目標(biāo)檢測(cè)抗體形成抗原-抗體復(fù)合物；3） 加酶標(biāo)抗原；4） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比。FORLIFESCIENCESBeaverFORLIFESCIENCESBeaver間接法檢測(cè)抗體:間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人免疫球蛋白抗體）以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體（人免疫球蛋白），故稱為間接法。本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。間接法的簡(jiǎn)要操作步驟：1） 將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原；2） 加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗-體復(fù)合物；3） 加酶標(biāo)抗抗體；4） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比。競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體:競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體的反應(yīng)模式與競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，抗HBcELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測(cè)一般米用此法。競(jìng)爭(zhēng)法的簡(jiǎn)要操作步驟：1） 先加入特異性抗原，使抗原固定結(jié)合于載體表面；2） 加入梯度濃度比例的待測(cè)樣品與酶標(biāo)抗體混合物，并做只加酶標(biāo)抗體的對(duì)照組；3） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的顯色差異，計(jì)算未知抗體的量。捕獲包被法檢測(cè)抗體:捕獲包被法（亦稱反向間接法）ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測(cè)定。以目前最常用的IgM測(cè)定為例，因血清中針對(duì)某種抗原的特異性IgM和IgG同時(shí)存在，則后者可干擾IgM的測(cè)定。因此先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測(cè)定特異性IgM°IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。類風(fēng)濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測(cè)定IgM抗體，導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。因此中和IgG的間接法近來(lái)頗受青睞，用這類試劑檢測(cè)抗CMVIgGM和抗弓形蟲(chóng)IgM抗體已獲成功。捕獲法測(cè)抗體的簡(jiǎn)要操作步驟：1） 特異性捕獲抗體的包被，先把能特異性結(jié)合待測(cè)抗原的抗體固定于固相載體表面；2） 加入待測(cè)樣品，通過(guò)固定在載體表面的針對(duì)該抗原的抗體固定于載體表面；3） 加入特異性抗原以及針對(duì)該特異性抗原的酶標(biāo)抗體；4） 加入酶促反應(yīng)底物，發(fā)生顯色反應(yīng)，顯色的深淺與待測(cè)抗體的量成正比。ABS-ELISA法：除以上6種ELISA測(cè)試方法外，近年在親和素-生物素系統(tǒng)上又發(fā)展出ABS-ELISA法。親和素是一種糖蛋白，每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成，生物素為小分子化合物。用化學(xué)方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與抗體或酶形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物，標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便，并且不影響抗體或酶原有的生物學(xué)活性。親和素生物素系統(tǒng)，簡(jiǎn)稱ABS（avidin-biotinsystem）。由于親和素與生物素間的親和力極強(qiáng)，結(jié)合迅速，且極其穩(wěn)定，使BAS標(biāo)記技術(shù)比常規(guī)酶聯(lián)免疫、放射免疫及熒光免疫技術(shù)有著更高的靈敏度，為微量抗原、抗體的檢測(cè)開(kāi)辟了新的途徑，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，但該方法比普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，因此在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多。ABS-ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體（抗原）。在LAB法中，將特異性抗體生物素化、酶分子標(biāo)記在親和素分子上，生物素化抗體與被檢抗原結(jié)合后，再借BAS的高度親和力將酶分子聯(lián)結(jié)到抗原分子上，經(jīng)酶促反應(yīng)即可檢出抗原，因此提高檢測(cè)的敏感度。ABC法同樣將特異性抗體生物素化、酶分子標(biāo)在生物素上，親和素和酶標(biāo)生物素需要先按一定比例形成ABC復(fù)合物，這種網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)結(jié)合了大量的酶分子，當(dāng)親和素尚未被酶標(biāo)生物素飽和時(shí)，生物素化抗體即可與之結(jié)合，使被檢抗原、生物素化抗體和酶標(biāo)生物素聯(lián)成一體。常見(jiàn)問(wèn)題及解決：陰性對(duì)照出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，造成該現(xiàn)象的原因有4個(gè)：1） 試劑或樣品可能被污染，或者由于孔之間的濺灑出現(xiàn)交叉污染。一一應(yīng)當(dāng)更換使用試劑，小心操作；2） 酶標(biāo)板洗板不徹底。一一嘗試用洗液充滿板孔確保每孔被充分洗滌，洗板前確保所有的剩余抗體溶液被倒凈；3） 抗體量過(guò)多導(dǎo)致非特異結(jié)合。一一應(yīng)該根據(jù)推薦用量使用抗體，盡量使用較少的抗體；4） 夾心法、捕獲法中檢測(cè)抗體與包被抗體/抗原反應(yīng)。一一確定使用的是正確的包被抗體和檢測(cè)抗體，兩者之間不會(huì)互相反應(yīng)。酶標(biāo)板整體背景高，造成該現(xiàn)象的原因有4個(gè)：1） 抗體非特異性結(jié)合。一一應(yīng)確保進(jìn)行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液，最好使用5%?10%的與二抗同種動(dòng)物來(lái)源的血清或牛血清，確保板孔經(jīng)過(guò)預(yù)處理以防止非特異結(jié)合，使用親和力強(qiáng)、純度高的抗體，最好經(jīng)過(guò)了預(yù)吸收處理；2） 底物結(jié)合濃度過(guò)高或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。一一應(yīng)調(diào)整底物的濃度，當(dāng)酶標(biāo)板顯色足夠進(jìn)行吸光度讀數(shù)時(shí)立即使用終止液終止反應(yīng)；3） 底物溶液不新鮮或被污染。一一應(yīng)檢測(cè)底物溶液，正常的底物溶液應(yīng)該是清亮透明的，如果變黃或其他顏色則是被污染的標(biāo)志；4） 底物孵育過(guò)程沒(méi)有避光。一一底物孵育應(yīng)該在避光環(huán)境下進(jìn)行。吸光度數(shù)值偏高或偏低，造成的該現(xiàn)象的原因有4個(gè)：1）樣品中待檢抗原含量太低會(huì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果偏低。一一可嘗試增加樣品的使用量或者更換一個(gè)檢測(cè)更靈敏的方法；

^BeaverFDRLIFESCIENCES2）加入抗體量不合適也會(huì)造成結(jié)果偏低或偏高一一應(yīng)確定使用的是建議抗體用量，或者為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的最適用量；3）孵育時(shí)間不夠長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏低。一一應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)抗體或抗原的孵育時(shí)間，確保待測(cè)樣品與檢測(cè)抗體能充分結(jié)合；4）孵育溫度