實(shí)驗(yàn)六菌落的PCR鑒定

實(shí)驗(yàn)六菌落的PCR鑒定

主講人：邢丹丹一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模和ㄟ^(guò)本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)菌落PCR反應(yīng)的基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理：重組子經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選后（具有假陽(yáng)性），接下來(lái)可通過(guò)菌落PCR方法對(duì)重組子進(jìn)一步進(jìn)行快速鑒定。以重組質(zhì)粒作為PCR擴(kuò)增模板。采用外源基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，如果重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，則可以擴(kuò)增得到預(yù)期大小的目的片段。為什么藍(lán)白斑篩選會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性：

有可能是載體自連的假陽(yáng)性。有時(shí)即使插入片段也會(huì)出現(xiàn)籃斑。只要編碼框沒(méi)被破壞。發(fā)生這種情況主要是目的片段插入后不能破壞編碼β半乳糖苷酶的讀碼框，使其依然能和宿主細(xì)胞的C端形成α互補(bǔ)。有可能連接體系有外源性核酸酶污染，使T-載體變?yōu)槠蕉?，連接后由于移碼，而生成白斑。藍(lán)白斑篩選結(jié)果三、儀器、材料與試劑PCR熱循環(huán)儀、臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器（0.1-2.5μL）、200μLPCR管、吸頭、離心管、手套、制冰機(jī)、微量移液器（10、100、1000μL量程各一支）、100mL或250mL錐形瓶、量筒、點(diǎn)樣板或parafilm、吸頭、PE手套和乳膠手套。四、PCR反應(yīng)體系1、模板：菌液2、引物：

P15′-CGGGTACCGGTGAATTAAGAGGAGAGAGGAGG-3′P25′-ACTCTAGATGAGTAAAACAGAGGAGGGTCTCAC-3′3、DNA聚合酶：Taq（本制品是94KD的耐熱性DNA聚合酶。它與天然的DNA聚合酶具有相同的功能。使用本制品擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物的3‘端附有一個(gè)A堿基，因此可直接克隆與T-Vector中。）4、原料：dNTPMixturedATP、dGTP、dCTP、dTTP等摩爾的混合物。5、反應(yīng)緩沖液10×PCRBuffer的組成。五、實(shí)驗(yàn)步驟

在200μLPCR管內(nèi)配制20μL反應(yīng)體系：反應(yīng)物體積/μL

模板DNA2.0

滅菌蒸餾水（ddH2O)10.310×PCR緩沖液2.0dNTP（2.5mM）1.6

引物1（2μM）2.0

引物2（2μM）2.0rTaq酶（1.0單位）0.1

Total20

將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，6,000rpm離心15sec使反應(yīng)成分集于管底。Mix（18

μL

）

用200μL的黃色槍頭挑取轉(zhuǎn)化平板上白色的單菌落于15μL無(wú)菌水中，吹打混勻，切記勿離心，從中取2μL菌液作為菌落PCR模板。

六、PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置①94℃預(yù)變性5min;②94℃變性30sec;③64℃退火30sec;30cycles④72℃延伸1min;⑤72℃延伸5min;⑥4℃pause

配制1％的瓊脂糖凝膠。取5μLPCR產(chǎn)物加1μL6×loadingbuffer于1%的瓊脂糖凝進(jìn)行電泳剩余的13μL菌液置4℃保存?zhèn)溆谩Ｆ?、搖菌從冰箱中取出氨芐青酶素，先放置冰上，彈勻后離心。取15mL的離心管，每個(gè)管中加2mL的LB液體培