重癥監(jiān)護(hù)室耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌相關(guān)耐藥基因的研究

重癥監(jiān)護(hù)室耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌相關(guān)耐藥基因的研究

銅綠假單胞菌是一種非發(fā)酵葡萄糖的革蘭陰性菌，屬于條件菌。近年來(lái),隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的應(yīng)用以及介入性醫(yī)療操作的廣泛開(kāi)展,銅綠假單胞菌已成為醫(yī)院感染和機(jī)會(huì)感染的主要病原菌。由于碳青霉烯類(lèi)藥物被臨床廣泛應(yīng)用,銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物產(chǎn)生了耐藥性,且對(duì)其耐藥率也逐年上升。因此加強(qiáng)對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物耐藥菌株的研究為臨床有效控制其感染提供科學(xué)依據(jù)顯得非常重要。1材料和方法1.1菌株的耐藥從本院重癥監(jiān)護(hù)室臨床感染標(biāo)本中分離獲得的44株對(duì)亞胺培南和美羅培南同時(shí)耐藥銅綠假單胞菌(各種標(biāo)本非重復(fù)菌株)。標(biāo)準(zhǔn)菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853,購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。1.2藥敏試驗(yàn)鑒定所有菌株均由VITEK-60自動(dòng)化分析系統(tǒng)鑒定確認(rèn),藥敏采用K-B紙片擴(kuò)散法測(cè)定銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的敏感性,并根據(jù)CLSI要求進(jìn)行抗菌藥物敏感性判斷。1.3材料和儀器全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀VITEK-60購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司,PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)PE公司。電泳儀為美國(guó)Bio-Rad產(chǎn)品。法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK-GNI(鑒定板)和MH瓊脂,K-B藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司,檢測(cè)DNA試劑和試劑盒由無(wú)錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。1.4統(tǒng)計(jì)方法用Whonet5.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.5dna模板液制備采用煮沸法。挑純菌落至PE管內(nèi)(內(nèi)置0.15mL滅菌蒸餾水),煮沸10min后立即放冷水上冷卻,4℃10000r/min離心5min,無(wú)菌取上清液即為DNA模板液,-20℃保存?zhèn)溆谩?.6pcr擴(kuò)增條件PCR引物設(shè)計(jì)為MP基因P1:5′CGGCCGCAGGAGAG-GCTTT3′,P2:5′AACCAGTTTTGCCTTTACCAT3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度587bp;GM基因P1:5′CTTGTAGCGTTGCCAGCTTTA3,P2:5′CAGCCCAAGAGCTAATTGAGG3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度562bp;SPM基因P1:5′CTGCTTGGATTCATGGGCGCG3′,P2:5′CCTTTTC-CCGACCTTGCTCG3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度784bp;VM基因P1:5′ATTCCGGTCGGAGAGGTCCG3′,P2:5′GAGCAAGTCTAGACCGCCCG3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度633bp;IMI基因P1:5′CCATTCAC-CCATCACAAC3′,P2:5′CTACCGCATAATCATTTGC3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度400bp;oprD2基因P1:5′GCGCATCTCCAAGACCATG3′,P2:5′GCCACGCGATTTGACGGAG3′,產(chǎn)物長(zhǎng)度193bp。PCR反應(yīng)體系一致:PCR反應(yīng)體系總體積為50ul。其中引物1μL,dNTP(200μmol/μL)1μL,10×緩沖液5μL,DNA模板2μL,TaqDNA聚合酶0.5μL,雙蒸水40.5μL。PCR擴(kuò)增條件為:94℃初變性5min,然后94℃變性1min,56℃退火30s,72℃延伸60s,共循環(huán)35周期,最后一個(gè)72℃延伸5min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,用溴苯乙錠染色,并用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察攝像保存。2結(jié)果2.1采樣區(qū)的來(lái)源分布見(jiàn)表1。2.2對(duì)左旋氧氟沙星和芽孢噻耐藥率的影響對(duì)阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、慶大霉素、頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶和頭孢吡肟耐藥率分別為13.6%、50.0%、31.8%、25.0%、40.9%和50.0%;對(duì)左旋氧氟沙星和頭孢噻肟耐藥率接近90%;亞胺培南、美洛培南、氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢西丁的耐藥率均為100%;多黏菌素敏感率100%。見(jiàn)表2。2.3耐藥基因檢測(cè)44株P(guān)AE中檢測(cè)到IMP陽(yáng)性6株,陽(yáng)性率13.6%,耐藥基因VIM3株,陽(yáng)性率6.8%,OprD2基因缺失21株,缺失率47.73%,其余耐藥基因GIM、SPM和IMI未檢出。3碳青霉烯酶及耐藥基因的檢測(cè)亞胺培南及美洛培南是碳青霉烯類(lèi)抗生素代表藥物,其抗菌譜極廣,抗菌活性強(qiáng),對(duì)包括超廣譜β內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶在內(nèi)的多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定,與第三代頭孢菌素?zé)o交叉耐藥性,被認(rèn)為是臨床上治療具有多重耐藥性的銅綠假單胞菌感染的重要抗菌藥物碳青霉烯酶是能夠明顯水解碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物的一類(lèi)β內(nèi)酰胺酶,它包括Ambler分子分類(lèi)中的A、B、D類(lèi)3類(lèi)酶,其中B類(lèi)為金屬酶,屬Bush分類(lèi)中的3組,是銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類(lèi)藥物的主要β內(nèi)酰胺酶,可由染色體、質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子介導(dǎo)。目前發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的金屬β內(nèi)酰胺酶有5種基因型:IMP、VIM、GIM、SPM和IMI5種,其中最主要的IMP和VIM已