手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1/4所屬類別：穩(wěn)定細(xì)胞株部文件編號(hào)：ACRO/QMS/SOP/SCL-19文件名稱：手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程生效日期：2017.2.28編制：王薇編寫日期：2016.04.20批準(zhǔn)人職位：部門主管批準(zhǔn)人：批準(zhǔn)日期：2017.2.28文件類別：SOP頁數(shù)：4版本號(hào)：1.3控制級(jí)別：控制文件1目的規(guī)范手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序。2適用范圍用于常規(guī)工程細(xì)胞（CHO、293E、293F等）手動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)。3適用責(zé)任本文件適用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室所有人員。4基本原理4.1計(jì)數(shù)室邊長(zhǎng)為1mm（400個(gè)小方格組成），則計(jì)數(shù)室面積為1mm2。蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室高度0.1mm，所有每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)體積為0.1mm3。具體示意圖如下：4.2一般計(jì)數(shù)293、CHO等常規(guī)細(xì)胞系，平均單個(gè)大方格中的細(xì)胞數(shù)量×懸液稀釋倍數(shù)/10-4即可算出每毫升中細(xì)胞個(gè)數(shù)即細(xì)胞密度。5儀器設(shè)備倒置生物顯微鏡、細(xì)胞計(jì)數(shù)板和蓋玻片、計(jì)數(shù)器、漩渦震蕩儀、移液槍及配套槍頭6試劑耗材0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液、1×PBS、超純水、無水乙醇；7操作程序7.1準(zhǔn)備工作7.1.1打開顯微鏡電源、漩渦震蕩儀電源；7.1.2按倒置熒光生物顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對(duì)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物，則需要重新清洗、風(fēng)干，蓋好蓋玻片準(zhǔn)備計(jì)數(shù)；7.2細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)7.2.1貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，按貼壁細(xì)胞傳代的標(biāo)準(zhǔn)操作流程制備單細(xì)胞懸液。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，則將細(xì)胞懸液混合均勻后取0.5ml用于EP管中計(jì)數(shù)。7.2.2將細(xì)胞懸液于漩渦震蕩儀上震蕩混勻；7.2.3均勻取50ul細(xì)胞懸液于另一EP管中，再補(bǔ)加適量體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)，于漩渦震蕩儀上震蕩混勻；7.2.4均勻取10ul細(xì)胞懸液，加樣至蓋玻片和計(jì)數(shù)板之間（若有加樣槽，加至加樣槽中），利用毛細(xì)管現(xiàn)象和液體表面張力使液體充滿計(jì)數(shù)室。（注：懸液加入量以不超過計(jì)數(shù)室臺(tái)面和蓋玻片間的矩形邊緣為宜；如果有可見氣泡或液體溢至矩形邊緣，需要將計(jì)數(shù)板清洗擦拭干凈后重新加樣）7.2.5靜置半分鐘，將計(jì)數(shù)板放置顯微鏡載物臺(tái)上，按倒置生物顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)操作流程在鏡下找到計(jì)數(shù)室；7.2.6用計(jì)數(shù)器記錄計(jì)數(shù)區(qū)域中活細(xì)胞個(gè)數(shù)和死細(xì)胞個(gè)數(shù)；（注：計(jì)數(shù)區(qū)由16個(gè)中方格組成，按對(duì)角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)。若細(xì)胞體位于中方格的雙線上，計(jì)數(shù)時(shí)則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，以減少誤差。）7.3細(xì)胞密度計(jì)算數(shù)n個(gè)大方格中細(xì)胞數(shù)量/n×懸液稀釋倍數(shù)/10-4即可算出每毫升中細(xì)胞個(gè)數(shù)即細(xì)胞密度。7.4計(jì)數(shù)后整理使用完畢，取下蓋玻片于計(jì)數(shù)板一起用超純水沖洗干凈，用無水乙醇脫水風(fēng)干后放入盒中保存。顯微鏡按倒置生物顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)操作流程歸置原位，關(guān)閉電源。8注意事項(xiàng)8.1對(duì)計(jì)數(shù)板清洗擦拭過程中，勿用硬物洗刷，以免破壞網(wǎng)格刻度，清洗后最好自行晾干，或用柔軟的擦鏡紙輕微擦干；通過鏡檢確定每小格內(nèi)是否有殘留菌體及染液沉淀物，若不干凈，必須重復(fù)洗滌直到干凈為止。8.2每個(gè)大方格控制在50個(gè)細(xì)胞為宜，計(jì)數(shù)誤差比較小。若每大格中細(xì)胞個(gè)數(shù)較多，可用工作濃度PBS將細(xì)胞懸液稀釋后計(jì)數(shù)。8.3向已經(jīng)蓋上玻片的計(jì)數(shù)板中加樣品，從某一點(diǎn)進(jìn)樣需一次性完成，流速要均勻，不可向下按壓蓋玻片。若有氣泡或鏡檢計(jì)數(shù)板中細(xì)胞分布明顯不均勻，需要清洗計(jì)數(shù)板，重懸加樣。修訂時(shí)間變更內(nèi)容變更后版本號(hào)修訂人2015.3.13更改排版1.1王薇2016.5.1表頭格式修改1.2石洋華2017.2.25公司Logo更新1.3張雅慧編制