手動細胞計數(shù)標準操作規(guī)程

1/4所屬類別：穩(wěn)定細胞株部文件編號：ACRO/QMS/SOP/SCL-19文件名稱：手動細胞計數(shù)標準操作規(guī)程生效日期：2017.2.28編制：王薇編寫日期：2016.04.20批準人職位：部門主管批準人：批準日期：2017.2.28文件類別：SOP頁數(shù)：4版本號：1.3控制級別：控制文件1目的規(guī)范手動細胞計數(shù)的標準操作程序。2適用范圍用于常規(guī)工程細胞（CHO、293E、293F等）手動細胞計數(shù)。3適用責任本文件適用于細胞實驗室所有人員。4基本原理4.1計數(shù)室邊長為1mm（400個小方格組成），則計數(shù)室面積為1mm2。蓋上蓋玻片后計數(shù)室高度0.1mm，所有每個計數(shù)區(qū)體積為0.1mm3。具體示意圖如下：4.2一般計數(shù)293、CHO等常規(guī)細胞系，平均單個大方格中的細胞數(shù)量×懸液稀釋倍數(shù)/10-4即可算出每毫升中細胞個數(shù)即細胞密度。5儀器設(shè)備倒置生物顯微鏡、細胞計數(shù)板和蓋玻片、計數(shù)器、漩渦震蕩儀、移液槍及配套槍頭6試劑耗材0.4%臺盼藍溶液、1×PBS、超純水、無水乙醇；7操作程序7.1準備工作7.1.1打開顯微鏡電源、漩渦震蕩儀電源；7.1.2按倒置熒光生物顯微鏡標準操作流程，對計數(shù)板計數(shù)室進行鏡檢，若有污物，則需要重新清洗、風干，蓋好蓋玻片準備計數(shù)；7.2細胞懸液計數(shù)7.2.1貼壁培養(yǎng)細胞，按貼壁細胞傳代的標準操作流程制備單細胞懸液。懸浮培養(yǎng)細胞，則將細胞懸液混合均勻后取0.5ml用于EP管中計數(shù)。7.2.2將細胞懸液于漩渦震蕩儀上震蕩混勻；7.2.3均勻取50ul細胞懸液于另一EP管中，再補加適量體積的0.4%臺盼藍，于漩渦震蕩儀上震蕩混勻；7.2.4均勻取10ul細胞懸液，加樣至蓋玻片和計數(shù)板之間（若有加樣槽，加至加樣槽中），利用毛細管現(xiàn)象和液體表面張力使液體充滿計數(shù)室。（注：懸液加入量以不超過計數(shù)室臺面和蓋玻片間的矩形邊緣為宜；如果有可見氣泡或液體溢至矩形邊緣，需要將計數(shù)板清洗擦拭干凈后重新加樣）7.2.5靜置半分鐘，將計數(shù)板放置顯微鏡載物臺上，按倒置生物顯微鏡標準操作流程在鏡下找到計數(shù)室；7.2.6用計數(shù)器記錄計數(shù)區(qū)域中活細胞個數(shù)和死細胞個數(shù)；（注：計數(shù)區(qū)由16個中方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格的細胞數(shù)。若細胞體位于中方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，以減少誤差。）7.3細胞密度計算數(shù)n個大方格中細胞數(shù)量/n×懸液稀釋倍數(shù)/10-4即可算出每毫升中細胞個數(shù)即細胞密度。7.4計數(shù)后整理使用完畢，取下蓋玻片于計數(shù)板一起用超純水沖洗干凈，用無水乙醇脫水風干后放入盒中保存。顯微鏡按倒置生物顯微鏡標準操作流程歸置原位，關(guān)閉電源。8注意事項8.1對計數(shù)板清洗擦拭過程中，勿用硬物洗刷，以免破壞網(wǎng)格刻度，清洗后最好自行晾干，或用柔軟的擦鏡紙輕微擦干；通過鏡檢確定每小格內(nèi)是否有殘留菌體及染液沉淀物，若不干凈，必須重復洗滌直到干凈為止。8.2每個大方格控制在50個細胞為宜，計數(shù)誤差比較小。若每大格中細胞個數(shù)較多，可用工作濃度PBS將細胞懸液稀釋后計數(shù)。8.3向已經(jīng)蓋上玻片的計數(shù)板中加樣品，從某一點進樣需一次性完成，流速要均勻，不可向下按壓蓋玻片。若有氣泡或鏡檢計數(shù)板中細胞分布明顯不均勻，需要清洗計數(shù)板，重懸加樣。修訂時間變更內(nèi)容變更后版本號修訂人2015.3.13更改排版1.1王薇2016.5.1表頭格式修改1.2石洋華2017.2.25公司Logo更新1.3張雅慧編制