高通量藥物篩選技課件

高通量藥物篩選技術(shù)運用自動化的篩選系統(tǒng)在短時間內(nèi)、在特定的篩選模型上完成數(shù)以千計，甚至萬計化合物樣品的活性測試。一般而言，日篩選能力應(yīng)在10000次以上方可以稱為高通量篩選。高通量藥物篩選技術(shù)運用自動化的篩選系統(tǒng)在短時間內(nèi)、在特定的篩1分子生物學(xué)細胞生物學(xué)基因組學(xué)蛋白組學(xué)生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)生物學(xué)計算機輔助藥物設(shè)計藥物化學(xué)高通量篩選技術(shù)天然產(chǎn)物化學(xué)合成組合化學(xué)化合物庫篩選模型結(jié)構(gòu)優(yōu)化先導(dǎo)化合物篩選—藥物發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

—高新技術(shù)集中的焦點分子生物學(xué)生物信息學(xué)高通量篩選天然產(chǎn)物化合物庫篩選模型結(jié)構(gòu)優(yōu)2TheEvolutionofHTSTheEvolutionofHTS3高通量篩選的特點快速----每天篩選上萬藥次微量----篩選樣品需要量為微克級靈敏----準(zhǔn)確判斷篩選樣品的活性和選擇性經(jīng)濟----篩選費用低高通量篩選的特點快速----每天篩選上萬藥次4高通量篩選的四個要素樣品制備自動化HTS模型建立數(shù)據(jù)處理高通量篩選的四個要素樣品制備自動化HTS模型建立數(shù)據(jù)處理5要素一：高通量篩選模型建立針對某一特定靶點，設(shè)計一種生物活性檢測方法并使之適用于高通量篩選。要素一：高通量篩選模型建立針對某一特定靶點，設(shè)計一種生物活性6選擇高通量篩選的靶點來源于基礎(chǔ)科學(xué)對于一種疾病進行細致研究后的理解和發(fā)現(xiàn)。根據(jù)這些結(jié)果，我們可以選擇其中關(guān)鍵的生物效應(yīng)環(huán)節(jié)進行干預(yù)。這些靶點包括受體、酶、激素、因子、離子通道和蛋白間的相互作用等。選擇高通量篩選的靶點來源于基礎(chǔ)科學(xué)對于一種疾病進行細致研究后7CurrentDrugTargetsMembraneReceptors 45%Enzymes 28%HormonesandFactors 11%IonChannels 5%DNA 2%NuclearReceptors 2%Unknown 7%N=483J.Drews,Science(2000)287:1962CurrentDrugTargetsMembraneR8克隆PCR、RT-PCR方法從cDNA文庫、EST克隆、組織和細胞的總RNA中得到關(guān)鍵靶基因亞克隆大腸桿菌表達系統(tǒng)酵母表達系統(tǒng)昆蟲表達系統(tǒng)大規(guī)模表達、純化、復(fù)性，得到純凈重組蛋白時間光吸收E412nm=13,600M-1cm-1檢測方法的確定、優(yōu)化及高通量篩選模型的建立分子水平篩選模型建立流程克隆亞克隆大規(guī)模表達、純化、復(fù)性，得到純凈重組蛋白時間光吸收9模型設(shè)計體外生化檢測通常通過體外生化檢測方法進行篩選的靶點包括酶、受體、蛋白與蛋白的相互作用等細胞水平的檢測主要用于信號傳導(dǎo)通路相關(guān)的靶點（包括受體、離子通道）以及為發(fā)現(xiàn)抗生素設(shè)計的篩選模型通過顯色反應(yīng)、熒光、化學(xué)發(fā)光以及同位素檢測技術(shù)測量生物反應(yīng)的終點。模型設(shè)計體外生化檢測10體外生化檢測體外生化檢測11顯色反應(yīng)

(Photometry)顯色反應(yīng)

(Photometry)12顯色反應(yīng)方法檢測MetAP活性顯色反應(yīng)方法檢測MetAP活性13顯色反應(yīng)方法檢測MetAP活性顯色反應(yīng)方法檢測MetAP活性14以酶為靶點以酶為靶點進行的高通量篩選的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)化涉及以下幾個步驟：確定反應(yīng)條件（如緩沖液、pH、溫度）天然或合成的底物的確定酶動力學(xué)信號窗口的評價對已知抑制劑的反應(yīng)情況底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物后，分別使用顯色反應(yīng)、熒光或放射性化學(xué)的方法等。適用的靶點不僅包括蛋白酶、激酶和磷酸酯酶，也包括其它酶類，如DNA連接酶和解旋酶。以酶為靶點以酶為靶點進行的高通量篩選的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)化涉及以下幾15細胞水平檢測細胞水平檢測16熒光成像檢測(FLIPR)貼壁細胞或懸浮細胞中Fluo-3的熒光強度，間接反映鈣離子的濃度。在FLIPR實驗中，可以用96孔或384孔板對多個樣品同時檢測，測定熒光強度的過程僅需1秒?？蛇M行鈣離子內(nèi)流的動力學(xué)檢測。熒光成像檢測(FLIPR)貼壁細胞或懸浮細胞中Fluo-3的17FLIPRfunctionalscreeningassayLGTPGDP

PLCinositolphosphatesCa2+Fluorescentdye+fluorescentsignalFLIPRfunctionalscreeningass18要素二：化合物樣品庫制備結(jié)構(gòu)多樣性（Chemicaldiversity）類藥性（Drug-like)要素二：化合物樣品庫制備結(jié)構(gòu)多樣性（Chemicaldiv19Lipinski規(guī)則MW<500分子量ClogP<5計算疏水常數(shù)Hbonddonors<5H鍵供體Hbondacceptors<10H鍵受體Lipinski規(guī)則MW<500分子量20Propertiesofan“Average”DrugPropertiesofan“Average”Dru21UndesirableCompoundsUnstableReactiveMichaelacceptorToxicLiquidGeneralmetalchelatorPolyaromaticmetallocompoundUndesirableCompoundsUnstable22篩選樣品來源傳統(tǒng)化學(xué)合成、分離合成化合物分離的天然產(chǎn)物純化合物和粗提物、有效部位組合化學(xué)合成從化合物數(shù)量和結(jié)構(gòu)多樣性上，充實供篩選的化合物庫與其他機構(gòu)的合作、交換或購買篩選樣品來源傳統(tǒng)化學(xué)合成、分離23傳統(tǒng)化學(xué)合成和分離單個合成、分步純化

一個化學(xué)工作者一年合成化合物的數(shù)量從不足一百個特點：數(shù)量相對較少，但各化合物相關(guān)數(shù)據(jù)全，質(zhì)量較高對特定的靶點SAR明確，對一個全新靶點，這些知識有助于產(chǎn)生新的先導(dǎo)化合物傳統(tǒng)化學(xué)合成和分離單個合成、分步純化24發(fā)掘天然產(chǎn)物資源大自然是另外一個能提供具有結(jié)構(gòu)多樣性小分子有機化合物的主要來源。經(jīng)典方法---分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、活性測試---費時、效率低，遠遠不能滿足現(xiàn)代高通量篩選的需要。這在一定程度上影響了天然產(chǎn)物來源的樣品在近年來的藥物研究中受重視程度。從結(jié)構(gòu)多樣性的角度考慮，大自然可能給予我們的結(jié)構(gòu)多樣性大大高于組合化學(xué)，因而天然產(chǎn)物或天然來源的樣品的重要性不容忽視。這也是現(xiàn)代天然產(chǎn)物化學(xué)研究的新的切入點。發(fā)掘天然產(chǎn)物資源大自然是另外一個能提供具有結(jié)構(gòu)多樣性小分子有25天然化合物庫（NatureProductPool）盡管許多天然產(chǎn)物在一些特定生物模型上被篩選過，但至今沒有多少化合物在所有現(xiàn)存的模型上被廣譜篩選過的事實似乎給我們這樣一種信息：隨著新的藥物篩選模型的不斷涌現(xiàn)，一些已知的天然化合物可能會被發(fā)現(xiàn)具有全新的生物活性。天然化合物庫（NatureProductPool）盡管許26天然產(chǎn)物對新藥發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的重要性天然產(chǎn)物，特別是植物中的天然產(chǎn)物作為藥物用途的歷史非常古老，為什么自然界能產(chǎn)生對人體疾病有效的物質(zhì)？為什么20世紀(jì)后半葉對從天然產(chǎn)物尋找新藥失去了興趣？為什么最近制藥企業(yè)又對來源于天然物的先導(dǎo)化合物產(chǎn)生了興趣？天然產(chǎn)物對新藥發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的重要性天然產(chǎn)物，特別是植物中的天然27為什么自然界能產(chǎn)生對人體疾病有效的物質(zhì)？化學(xué)家和生物化學(xué)家對次級代謝產(chǎn)物（所有非蛋白天然產(chǎn)物）的產(chǎn)生提出了六種主要的假設(shè)，Haslam歸納如下：1）次級代謝產(chǎn)物是無特定生理功能的單純排泄物；2）次級代謝產(chǎn)物曾經(jīng)起過功能代謝作用，但目前其作用已失去；3）次級代謝產(chǎn)物是所有體內(nèi)變化的產(chǎn)物，在生物體內(nèi)沒有任何真正的作用；4）次級代謝產(chǎn)物是進化過程中的一例，在新化合物產(chǎn)生之前，次級代謝物是為了保存進化所必需的物質(zhì)而存在；5）次級代謝產(chǎn)物為初級代謝所不需要的酶提供發(fā)揮作用的場所，重要的是次級代謝過程，而不是次級代謝產(chǎn)物；6）次級代謝能產(chǎn)生防御物質(zhì)和其他重要的生理活性物質(zhì)，對生物體的生存具有重要作用。為什么自然界能產(chǎn)生對人體疾病有效的物質(zhì)？化學(xué)家和生物化學(xué)家對28為什么20世紀(jì)后半葉對從天然產(chǎn)物尋找新藥失去了興趣？20世紀(jì)70年代末興起的組合化學(xué)的發(fā)展使得短期有效合成上萬個化合物成為可能；隨著具有自動化系統(tǒng)的高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，每天可以篩選50000個以上的樣品，為組合化學(xué)合成的樣品提供一種快速篩選方法；天然生理活性物質(zhì)分離的復(fù)雜化和大量生物材料獲得不易。為什么20世紀(jì)后半葉對從天然產(chǎn)物尋找新藥失去了興趣？20世紀(jì)29天然產(chǎn)物研究的復(fù)活天然產(chǎn)物研究的成功天然產(chǎn)物研究的獨特性新篩選方法的影響天然產(chǎn)物研究的復(fù)活天然產(chǎn)物研究的成功30根據(jù)新藥的研發(fā)過程設(shè)計有效的天然產(chǎn)物研究方法天然材料的獲得和提取有效的篩選方法天然生理活性物質(zhì)的分離快速有效的結(jié)構(gòu)解析方法生物學(xué)的評價天然生理活性物質(zhì)的大量獲得構(gòu)效關(guān)系研究根據(jù)新藥的研發(fā)過程設(shè)計有效的天然產(chǎn)物研究方法天然材料的獲得和31天然產(chǎn)物或其類似物作為藥品實例61%of877smallmoleculedrugsintroducedworldwideduringtheperiod1981-2002canbetracedto,orwereinspiredby,naturalproducts.天然產(chǎn)物或其類似物作為藥品實例61%of877smal32洛伐他汀(Lovastatin)(HMG-CoA抑制劑）Compactin:R1=R2=HMevinolin:R1=CH3,R2=HSimvastin:R1=CH3,R2=CH3PravastatinFluvastatinCerivastinAtorvastin洛伐他汀(Lovastatin)(HMG-CoA抑制劑）C33環(huán)孢菌素A（CyclosporineA）真菌Trichodermapolysporum分離抑制器官移植排異反應(yīng)的免疫抑制劑環(huán)孢菌素A（CyclosporineA）真菌Trichod34紫杉醇紫杉醇(1,Paclitaxel,Taxol)是從太平洋紅豆杉Taxusbrevifolia樹皮中提取分離得到的天然二萜化合物。多西紫杉醇(2,Docetaxel,Taxotere)是在紫杉醇的結(jié)構(gòu)修飾和改造過程中通過半合成方法得到的。2001年全世界紫杉醇年銷售額在20億美元以上，多西紫杉醇年銷售額達到10億美元以上。這兩種藥物已經(jīng)成為當(dāng)前，也是歷史上最為暢銷的抗癌藥物。紫杉醇紫杉醇(1,Paclitaxel,Taxol)是從35喜樹堿及其衍生物CamptothecinR1=R2=R3=HTopotecanR1=H,R2=CH2N(CH3)2,R3=OHIrinotecanR1=CH2CH3,R2=H,R3=(A)9-AminocamptothecinR1=R3=H,R2=NH29-NitrocamptothecinR1=R3=H,R2=NO2(A)喜樹堿及其衍生物是DNA局所異構(gòu)酶Ⅱ(DNAtoposomeraseⅡ

抑制劑。喜樹堿及其衍生物CamptothecinR1=R2=R3=36嗎啡生物堿Morphine,R=HCodeine,R=CH3Buprenorphone,活性為Morphine25－50倍，成癮性低于嗎啡。Pentazocine,活性僅為嗎啡的30％，但成癮性極低嗎啡生物堿Morphine,R=HBuprenorphone37天然產(chǎn)物研究的未來利用組合化學(xué)合成“非天然的天然物”或“類天然產(chǎn)物庫”多樣性導(dǎo)向合成(diversity-orientedsynthesis)天然產(chǎn)物研究的未來利用組合化學(xué)合成“非天然的天然物”或“類天38Galanthamine四環(huán)骨架化合物庫的建立和分泌途徑抑制劑及高爾基-質(zhì)膜運輸抑制劑SecramineA的發(fā)現(xiàn)ShairMDandKirchhausenT.Naturechemicalbiology,2006,2:39-462527compoundsweresynthesizedGalanthamine四環(huán)骨架化合物庫的建立和分泌途徑抑39CompoundStorageSolidLong-termstorageDMSOsolutionLong-termstorage(10year?)WorkingsolutionsCompoundStorageSolid40CompoundplatesMotherPlatesDMSOsolutionsfromvendorsDaughterPlatesDMSOsolutions1mg/mlAssayPlatesAqueoussolutions25μg/mLcompound2.5%DMSO20μL80Compounds352Compounds88CompoundsCompoundplatesMotherPlates8041Samplemanagementtechnology化合物庫是醫(yī)藥公司和研究機構(gòu)最寶貴的資產(chǎn)。其數(shù)量和質(zhì)量的重要性需要高可靠性的自動化儲存和檢索系統(tǒng)。專業(yè)的樣品管理公司可提供整套的樣品管理產(chǎn)品，包括：自動化的儲存系統(tǒng)大型系統(tǒng)可儲存60,000,000樣品。儲存環(huán)境溫度可達到-80℃。自動化樣品處理設(shè)備樣品稱量、溶解，微孔板間復(fù)制，封膜，Cherrypicking。軟件儲存系統(tǒng)控制軟件，樣品管理系統(tǒng)軟件。耗材微孔板，微試管，封膜，Barcode.Samplemanagementtechnology化合42Samplemanagementtechnology瑞士Tecan公司的樣品自動化儲存系統(tǒng)產(chǎn)品ClicktoviewthevideoREMPLarge-sizestoreTM(LSS)Samplemanagementtechnology瑞士43要素三：自動化自動化技術(shù)的應(yīng)用，提高篩選效率，擺脫人為誤差因素要素三：自動化自動化技術(shù)的應(yīng)用，提高篩選效率，擺脫人為誤差因44微孔板（Microplate）

微孔板（Microplate）是許多方法和解決方案的最終決定因素。盡管近年來的芯片技術(shù)發(fā)展很快，但微孔板在生物醫(yī)藥研究中仍扮演著不可替代的角色。正是微孔板的應(yīng)用使人們提出了將多個反應(yīng)管以平行方式同時處理的概念，這些概念一定程度上大大促進了自動化篩選系統(tǒng)和工作站的快速發(fā)展。對于所有開發(fā)的儀器而言，微孔板是一個共同的標(biāo)準(zhǔn)，同時標(biāo)準(zhǔn)化的要求也增加了現(xiàn)代自動化系統(tǒng)的可靠性。其中，96孔板和384孔板都已經(jīng)制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)(SocietyofBiomolecularScreeningtaskforce"Standards"inAutomationandinstrumentation)。但是其他的高密度板，如864、1536、3456，甚至9600孔板目前還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。這些標(biāo)準(zhǔn)或準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)板的使用已經(jīng)大大地降低了篩選成本，同時增加了通量。

微孔板（Microplate）微孔板（Microplate45Microplates微孔板是篩選的載體，其制造技術(shù)也隨著篩選技術(shù)的發(fā)展而發(fā)展，包括：微孔板的顏色和材料微孔板微孔的設(shè)計和密度微孔板材料的表面處理Microplates微孔板是篩選的載體，其制造技術(shù)也隨著46MicroplatesfromCorningMicroplatesfromCorning47MatrixofWells864963841536 Well Row Column Volume 96 8 12 300 384 16 24 100 1536 32 48 10MatrixofWells864963841536 48Microplates微孔板的顏色和材料Microplates微孔板的顏色和材料49Microplates微孔板微孔的設(shè)計和密度微孔板微孔密度的增加可以顯著提高單位時間內(nèi)篩選的通量。節(jié)約成本。提高篩選質(zhì)量。Microplates微孔板微孔的設(shè)計和密度50Microplates微孔板材料的表面處理Microplates微孔板材料的表面處理51微孔板設(shè)備一般而言，一個自動化篩選系統(tǒng)的大多數(shù)組件總是圍繞微孔板而工作的，它們均可稱為微孔板設(shè)備。獨立單元（Stand-alone）：指象洗板器、液體分配器（LiquidDispenser）和酶標(biāo)儀等工作站（Workstation）：能執(zhí)行多重功能（通常指圍繞微孔板）的部分，如液體轉(zhuǎn)移裝置（LiquidHandling）可圍繞微孔板執(zhí)行多重功能微孔板設(shè)備一般而言，一個自動化篩選系統(tǒng)的大多數(shù)組件總是圍繞微52History–1980’s,Zymark世界上第一臺工作站是由Zymark公司開發(fā)的BenchmateTM系統(tǒng)，它集成了精密天平、單通道加液頭、移液裝置、振蕩器和HPLC進樣器等。通過一個機械臂可以將不同的容器從一個工作臺移至另一個工作臺，但這一系統(tǒng)主要是針對管形反應(yīng)器設(shè)計而設(shè)計的，并不適用于今天的微孔板。History–1980’s,Zymark世界上第一臺工53第一臺基于于微孔板設(shè)計的工作站是由BeckmanCoulter開發(fā)的Biomek1000，它整合了單通道和多通道的吸液、加液、洗滌和單通道檢測（密度測定）等組件部分。Biomek2000：

使用可變換工具后變得更加靈活，如不同的吸收器、分配器等。其特點是可以針對不同的需要設(shè)計不同的操作程序。BiomekFX：集成了更強大的功能，如多通道可同時、亦可執(zhí)行不同的任務(wù)，雙手臂操作則更是增加了有效性和操作速度。第一臺基于于微孔板設(shè)計的工作站是由BeckmanCoult54Biomek?2000AutomationWorkstation

Biomek?2000AutomationWorkst55自動化液體分配裝置自動化液體分配裝置56檢測系統(tǒng)UV-visibleLightAbsorbanceFluorescenceFluorescenceIntensityTime-resolvedFluorescence(TRF)FluorescencePolarization(FP)LuminescenceRadioactivity檢測系統(tǒng)UV-visibleLightAbsorbanc57MicroplateReadersSpectraMaxPlus384

UVabsorbanceContinuous190-1000nm,Reads96wells,5sec;384wells,16secSpec