肉制品中致病菌的檢測(cè)（沙門(mén)氏菌）-致病菌檢測(cè)的方法

致病菌檢測(cè)的方法

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沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)方法二致病菌檢驗(yàn)方法1.大腸埃希氏菌檢驗(yàn)方法2.志賀氏菌檢驗(yàn)方法3.金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法4.副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法5.蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)方法（大腸埃希氏菌檢驗(yàn)方法）大腸埃希氏菌檢驗(yàn)方法國(guó)標(biāo)法參看食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)(GB/T4789.6)。檢測(cè)大腸桿菌及其腸毒素的新技術(shù)、新方法很多。如用K88單抗血清對(duì)糞中K88菌檢出率比常規(guī)培養(yǎng)法提高1倍，最小檢測(cè)菌量為10000cfu/mL。987P酶標(biāo)單抗對(duì)糞便和腸內(nèi)容物最小檢出菌量為2000cfu/mL。對(duì)致病性大腸桿菌毒力基因檢測(cè)，過(guò)去多用動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定，現(xiàn)可用其單抗以多種免疫學(xué)手段檢出。如用免疫磁分離法檢測(cè)牛糞便和食品標(biāo)本的大腸桿菌O157：H7，可提高了大腸桿菌O157：H7感染病例的檢出率。（志賀氏菌檢驗(yàn)方法志賀氏菌檢驗(yàn)方法目前志賀氏菌檢驗(yàn)多采用國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.5)。（金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)方法MPN法：適用于檢測(cè)帶有大量競(jìng)爭(zhēng)菌的食品及其原料和未經(jīng)處理的含少量金黃色葡萄球菌的食品。直接平板計(jì)數(shù)法：適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10/g（ml）的食品增菌培養(yǎng)法：適用于檢查含有受損傷的金黃色葡萄球菌的加工食品。定量方法定性方法（副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法副溶血性弧菌的檢驗(yàn)多采用國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.7)（蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)方法）蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)方法蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)多采用國(guó)標(biāo)法(GB/T4789.28)。國(guó)標(biāo)法免疫學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法

分子生物學(xué)方法其他檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)方法（國(guó)標(biāo)法）國(guó)標(biāo)法GB4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》對(duì)沙門(mén)氏菌的常規(guī)檢驗(yàn)包括以下5個(gè)基本步驟：預(yù)增菌和增菌；分離；生化試驗(yàn)；血清學(xué)鑒定；血清學(xué)分型(選做項(xiàng)目)；結(jié)果與報(bào)告。免疫學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA).斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-ELISA）.免疫熒光抗體技術(shù).其它免疫學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法（免疫學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法）（免疫學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法）免疫學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法免疫標(biāo)記技術(shù)就是將已知抗體或者抗原上標(biāo)記上易顯示的物質(zhì)(標(biāo)記分子)，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物反映有無(wú)抗原抗體反應(yīng),從而間接檢測(cè)出微量的抗原或者抗體。

所謂的標(biāo)記分子是那些即使在超微量時(shí)也能通過(guò)特殊的方法將其檢測(cè)出來(lái)，高敏感性的標(biāo)記分子主要有突光素、酶、放射性同位素3種。免疫標(biāo)記技術(shù)不僅大大提高了試驗(yàn)的敏感性，和光鏡或電鏡技術(shù)結(jié)合后，能對(duì)待檢物質(zhì)做精細(xì)定位，為臨床研究和診斷提供了極大的方便。（酶聯(lián)免疫吸附法）

酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)ELISA的原理是是把抗原或抗體預(yù)先結(jié)合在某種固相載體表面，然后加入受檢樣品和酶標(biāo)抗原或抗體使其與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體起反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌去除反應(yīng)液中其他物質(zhì)，加入酶反應(yīng)底物后，底物被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，最后通過(guò)定性或定量分析有色產(chǎn)物即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)含量。該法靈敏度高、特異性強(qiáng)，可避免人為因素造成的假陰性，且能在短時(shí)間內(nèi)快速篩去大量的陰性樣品，（斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法）斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-ELISA）Dot-ELISA是以纖維素膜作為固相載體的一種新型免疫檢測(cè)技術(shù)，其原理與常規(guī)ELISA法相同，可用于抗原或抗體的定性或定量檢測(cè)。其與ELISA的不同之處在于：一是將固相載體以硝酸纖維素濾膜、確酸醋酸混合纖維素濾膜、重氮節(jié)氧甲基化紙等固相化基質(zhì)膜代替，用以吸附抗原或抗體；二是顯色底物的供氫體為不溶性的，結(jié)果在基質(zhì)膜上出現(xiàn)有色斑點(diǎn)進(jìn)行判定。該方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏、特異性強(qiáng)等特點(diǎn),并具有較高的可重復(fù)性，而且陽(yáng)性反應(yīng)色斑易于觀察,陽(yáng)性檢出率也高于常規(guī)分離培養(yǎng)法，且整個(gè)操作過(guò)程不需要任何特殊儀器，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)，可以節(jié)省大量人力、物力、財(cái)力，便于在基層單位推廣應(yīng)用（免疫熒光抗體技術(shù)）免疫熒光抗體技術(shù)免疫熒光抗體技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色)，可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。（其它免疫學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法）其它免疫學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法免疫磁性分離法是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，通過(guò)與樣品中靶細(xì)菌的特異性結(jié)合和外加磁場(chǎng)的作用，使靶細(xì)菌得到分離、濃縮。此技術(shù)直接檢測(cè)細(xì)菌特異性好，但靈敏度低。分子生物學(xué)方法.核酸探針.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR).環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）.基因芯片技術(shù)（分子生物學(xué)方法）（核酸探針）核酸探針通過(guò)酶切質(zhì)粒DNA來(lái)進(jìn)行，它主要采用一定數(shù)量的限制性內(nèi)切酶，對(duì)提純質(zhì)粒的DNA酶切，分別得到不同DNA片斷，用于檢測(cè)食品中沙門(mén)氏菌的存在（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)PCR技術(shù)是一項(xiàng)體外酶促擴(kuò)增DNA技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡(jiǎn)便、快速高效等特點(diǎn)。目前，PCR技術(shù)是一種快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法。（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）LAMP技術(shù)的原理是針對(duì)靶基因的6

個(gè)區(qū)域按照規(guī)定的順序設(shè)計(jì)4種特異的引物，因此

LAMP

技術(shù)擴(kuò)增的特異性很高，只要出現(xiàn)擴(kuò)增就可以判定靶基因存在。同時(shí)，在DNA

延伸合成過(guò)程中，從

dNTP

中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子結(jié)合，會(huì)產(chǎn)生白色的焦磷酸鎂沉淀。

因此只要用肉眼觀察白色混濁沉淀，就能鑒定擴(kuò)增與否[25]。LAMP

技術(shù)具備操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、反應(yīng)快速、靈敏度高的特點(diǎn)，LAMP

技術(shù)在微生物檢測(cè)方面上得到了廣泛的應(yīng)用。（基因芯片技術(shù)）基因芯片技術(shù)基因芯片是一種固定有很多已知序列

DNA

探針的硅片或玻片。將經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的樣品分子與基因芯片上的

DNA探針進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針?lè)肿拥臒晒庑盘?hào)強(qiáng)度以得到樣品分子的數(shù)量和序列信息，基因芯片表面的

DNA

探針從幾十到幾百萬(wàn)個(gè)不等，可以一次性檢測(cè)多種病原菌，并同時(shí)得到病原菌的耐藥性等情況。（噬菌體法）噬菌體法噬菌體對(duì)細(xì)菌有特殊的裂解作用。其方法是挑取鑒別培養(yǎng)基上的可疑菌落，作胨水培養(yǎng)(37℃過(guò)夜)，若菌液渾濁，作1:200稀釋，再用滅菌棉簽在烘干的瓊脂平皿上作條狀涂布，待平板菌液干燥后，用微量加樣器依次在每個(gè)區(qū)域滴加沙門(mén)氏菌噬菌體進(jìn)行裂解試驗(yàn)。（微量熱量測(cè)定法）