中藥制劑的含量測定

第五章中藥制劑的含量測定

學(xué)習(xí)目標(biāo)1.解釋化學(xué)分析法、紫外-可見分光光度法、薄層掃描法、高效液相色譜法、氣相色譜法原理以及在中藥制劑分析中的應(yīng)用2.說出含量測定方法各效能指標(biāo)的含義3.知道熒光分析法、原子吸收分光光度法原理和應(yīng)用第一節(jié)含量測定的目的與意義

在我國藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，[鑒別]、[檢查]和[含量測定]項(xiàng)目是判定中藥制劑質(zhì)量優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)。

中藥制劑的鑒別是研究某種原料藥或成分的存在與否，從而判定藥物的真?zhèn)?，而含量測定項(xiàng)目是研究某種成分的含量高低是否符合規(guī)定來判定藥物的優(yōu)劣。中藥制劑的含量測定是質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

通過測定制劑中有效成分、毒性成分或某些指標(biāo)性成分的含量來衡量其制劑工藝的穩(wěn)定性和中藥材的質(zhì)量優(yōu)劣，以保證中藥制劑的質(zhì)量，達(dá)到臨床用藥安全、有效和中藥制劑進(jìn)入國際市場的需要。

有效成分毒性成分指標(biāo)性成分衡量工藝、保證質(zhì)量第二節(jié)常用定量分析方法

一、化學(xué)分析法分類重量分析滴定分析特點(diǎn)儀器簡單結(jié)果準(zhǔn)確測定：含量較高成分礦物藥制劑中無機(jī)成分如總生物堿類、總酸類、總皂苷及礦物藥制劑等。

化學(xué)分析法有一定的局限性，其靈敏度低，操作繁瑣、耗時(shí)長，專屬性不高，對(duì)于微量成分準(zhǔn)確性不理想。（一）重量分析法揮發(fā)法萃取法沉淀法如：①供試品的干燥失重測定；②水分測定均屬揮發(fā)法；③中藥制劑分析中灰分及熾灼殘?jiān)臏y定等。揮發(fā)法測定具有揮發(fā)性或能定量轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性物質(zhì)的組分含量。萃取法根據(jù)被測組分在互不相溶的兩相中溶解度的不同，達(dá)到分離的目的。如：①冰硼散中冰片的含量測定；②地奧心血康膠囊中甾體總皂苷含量測定；③昆明山海棠片中總生物堿的含量測定；④甘草浸膏中甘草酸的含量測定即采用萃取法。沉淀法將被測組分定量轉(zhuǎn)化為難溶化合物，測定其含量的方法，適用于制劑中純度較高的成分。如：①西瓜霜潤喉片中西瓜霜的含量測定；②苦參片中苦參總堿的含量測定；③復(fù)方元胡注射液總堿的測定。（二）滴定分析法酸堿滴定法沉淀滴定法配位滴定法氧化還原滴定法酸堿滴定法適用于測定中藥制劑中所含有的生物堿、有機(jī)酸、內(nèi)酯類等酸、堿組分的含量。沉淀滴定法主要用于生物堿、生物堿的氫鹵酸鹽及含鹵素的其他有機(jī)成分的含量測定。滴定開始磚紅色滴定終點(diǎn)用AgNO3滴定液滴定氯化物

Ag++Cl-→AgCl↓2Ag++CrO42-→Ag2CrO4↓鉻酸鉀指示劑如：①萬氏牛黃清心丸等的含量測定就采用硫氰酸銨法；②牛黃解毒片中石膏的含量測定。配位滴定法包括EDTA法和硫氰酸銨法，在中藥制劑分析中，用以測定鞣質(zhì)、生物堿及含Ca2+、Mg2+、Fe3+、Hg2+等礦物類制劑的含量。如：①磁朱丸中全鐵的含量測定采用鈰量法；②牛黃解毒片中雄黃的含量測定；③丹皮酚注射液中丹皮酚的含量測。

氧化還原滴定法適用于測定具有氧化還原性的物質(zhì)，如含酚類、糖類及礦物藥Fe、As等成分的中藥制劑。該法是中藥及其制劑含量測定的一種常用方法。二、可見-紫外分光光度法優(yōu)點(diǎn)靈敏度高精度好操作簡便該法要求被測成分本身或其顯色產(chǎn)物對(duì)可見-紫外光具有選擇性吸收。按測定波長數(shù)目不同分為單波長光譜法和多波長光譜法。實(shí)際應(yīng)用中常用單波長光譜法。

分類方法特點(diǎn)吸收系數(shù)法測定所配供試品溶液在規(guī)定波長的吸收度，根據(jù)被測成分的吸收系數(shù)（E1%1cm）計(jì)算其含量①對(duì)儀器要求高，使用該法時(shí)，應(yīng)注意儀器波長、空白吸收的校正，吸收度準(zhǔn)確度的檢定和雜散光的檢查②無需對(duì)照品，方法簡便對(duì)照品比較法在同樣條件下配制對(duì)照品溶液和供試溶液，且使前者中所含被測成分的量應(yīng)為后者中被測成分的量的100%±10%，用規(guī)定波測定二者的吸收度，則可計(jì)算出供試品中被測成分的濃度或含量對(duì)儀器要求較高標(biāo)準(zhǔn)曲線法配制一系列不同濃度的對(duì)照品溶液（常為5個(gè)），在相同條件下分別測定吸收度，繪制A-C曲線，或求出其回歸直線方程（相關(guān)系數(shù)r≥0.999），即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下，測定供試品溶液的吸收度，就可求得供試品中被測成分的濃度或含量。①本法對(duì)儀器的精度要求不高，有時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線不通過原點(diǎn)，只要重現(xiàn)性好也可使用②該法在比色法中最常用薄層掃描法是用一定波長的光照射在薄層板上，對(duì)薄層色譜中吸收紫外光或可見光的斑點(diǎn)，或經(jīng)激發(fā)后能發(fā)射出熒光的斑點(diǎn)進(jìn)行掃描，將掃描得到的圖譜及積分?jǐn)?shù)據(jù)用于藥品的鑒別、雜質(zhì)檢查或含量測定。三、薄層掃描法

薄層掃描法是以薄層色譜法為基礎(chǔ)發(fā)展起來的薄層色譜組分原位分析方法及薄層色譜的記錄方法，又稱薄層色譜掃描法（TLCS），相應(yīng)儀器稱為薄層掃描儀（ThinLayerChromatogramScanner）。（一）基本原理

薄層掃描法是指薄層色譜斑點(diǎn)的色譜掃描，薄層色譜掃描是指固定波長，斑點(diǎn)移動(dòng)，測定A-l或F-l曲線。根據(jù)薄層掃描的測定方式分為薄層吸收掃描法和薄層熒光掃描法二種方法。1、薄層吸收掃描法

基本原理：Kubelka-Munk理論及曲線。由于薄層板存在明顯的散射現(xiàn)象，斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度的關(guān)系需用Kubelka-Munk理論及曲線來描述。Kubelka-Munk理論以斑點(diǎn)的相對(duì)反射率和相對(duì)透光率計(jì)算薄層色譜斑點(diǎn)的吸光度，說明了固定相的散射參數(shù)SX對(duì)斑點(diǎn)中物質(zhì)的濃度與吸光度間關(guān)系的影響，獲得不同散射參數(shù)SX時(shí)斑點(diǎn)的A-KX理論曲線，即Kubelka-Munk曲線。光源：鎢燈和氘燈；靈敏度：在200-800nm波長范圍內(nèi)選擇合適波長進(jìn)行測定，其靈敏度可達(dá)ng級(jí)；適用范圍：適用于在可見、紫外區(qū)有吸收的物質(zhì)，及通過色譜前或色譜后衍生成上述化合物的樣品組分。2、薄層熒光掃描法基本原理：F=2.3K’I。ECL或F=KC光源：氙燈或汞燈。靈敏度：最低可測到10-50pg。適用范圍：適合于本身具有熒光或經(jīng)過適當(dāng)處理后可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的測定。

Kubelka-Munk理論不適用于薄層熒光掃描，無需進(jìn)行曲線校直。用薄層熒光掃描進(jìn)行定量分析時(shí)，用斑點(diǎn)熒光強(qiáng)度的積分值（色譜峰峰面積）與斑點(diǎn)中組分的含量代替上式中F與C進(jìn)行運(yùn)算。（二）定量分析方法外標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法追加法回歸曲線①外標(biāo)一點(diǎn)法工作曲線通過原點(diǎn)（截距為零）時(shí)可用外標(biāo)一點(diǎn)法定量。只需點(diǎn)一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，與供試液同板展開，對(duì)比，測定組分含量，其計(jì)算公式為：C=F1·A

式中：C為組分的重量或濃度，A為測得該組分的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)。外標(biāo)法外標(biāo)法是薄層色譜掃描最常用的定量方法，方法簡便，但點(diǎn)樣必須準(zhǔn)確。②外標(biāo)二點(diǎn)法工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)，只能用外標(biāo)二點(diǎn)法定量，至少需點(diǎn)二種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（或一種濃度兩種點(diǎn)樣量），才能決定一直線,其計(jì)算公式為：C=F1A+F2式中：C、A同前，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為縱坐標(biāo)的截距，F(xiàn)1和F2值由儀器自動(dòng)算出。

外標(biāo)一點(diǎn)法、二點(diǎn)法只是指用一種或二種濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)比定量，為減小誤差，同一薄板上供試品點(diǎn)樣不得少于4個(gè)，對(duì)照品每一濃度不得少于2個(gè)；并調(diào)整標(biāo)淮溶液的濃度或供試品與標(biāo)準(zhǔn)溶液的點(diǎn)樣量，使其峰面積相接近；且點(diǎn)樣量必須準(zhǔn)確，宜用定量毛細(xì)管點(diǎn)樣。

內(nèi)標(biāo)物的選擇要求是：

純度合乎要求，展開后不得有雜質(zhì)斑點(diǎn)，否則內(nèi)標(biāo)斑點(diǎn)的峰面積將不能代表內(nèi)標(biāo)物的量。內(nèi)標(biāo)物須為樣品中所不含有的成分。內(nèi)標(biāo)物不與其它斑點(diǎn)相重疊，分離度合乎要求。為簡化計(jì)算，內(nèi)標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)溶液及供試品溶液中的濃度應(yīng)相等。內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法是選一個(gè)純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，并準(zhǔn)確稱取一定量內(nèi)標(biāo)物加至供試液及標(biāo)準(zhǔn)液中，計(jì)算供試品溶液中某組分含量的定量方法。特點(diǎn)：1）在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確度與點(diǎn)樣量無關(guān)。

2）不易找到適宜Rf值的純品內(nèi)標(biāo)物，且溶液配制等操作較麻煩。方法：1）內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法：當(dāng)工作曲線通過原點(diǎn)時(shí)采用內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法。內(nèi)標(biāo)一點(diǎn)法公式：

2）工作曲線不通過原點(diǎn)時(shí)必須采用內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法內(nèi)標(biāo)二點(diǎn)法公式：

式中：C、Cis分別為組分及內(nèi)標(biāo)物的濃度或重量，A、Ais分別為測得組分及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，F(xiàn)1為直線的斜率或比例常數(shù)，F(xiàn)2為截距，F(xiàn)1和F2由儀器自動(dòng)計(jì)算并內(nèi)存，可直接給出樣品的濃度或重量。適用于成分復(fù)雜供試品的定量分析，既具有內(nèi)標(biāo)法的特點(diǎn)又不需要內(nèi)標(biāo)物，詳見HPLC法。追加法（疊加法）將不同濃度（或不同量）的標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試液點(diǎn)在同一塊薄層板上，展開、掃描由計(jì)算機(jī)對(duì)所測得的峰面積及相應(yīng)點(diǎn)樣量進(jìn)行線性或非線性回歸直接由回歸方程或回歸曲線計(jì)算供試液含量的方法。

CAMAG系列薄層掃描儀即采用此方法?；貧w曲線定量法（三）操作要點(diǎn)（1）線性考察

①檢查所選擇的散射參數(shù)SX值是否適宜。SX值適宜則工作曲線被校直為直線，否則，調(diào)整SX值再校正，直至在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線成直線為止。②考察工作曲線是否過原點(diǎn)，以便確定采用一點(diǎn)法或二點(diǎn)法定量。③確定點(diǎn)樣量的線性范圍。既使采用曲線校直，也只是在一定點(diǎn)樣量范圍內(nèi)工作曲線為直線，因此需確定點(diǎn)樣量的上、下限。為降低定量誤差，最好調(diào)整點(diǎn)樣量，使供試品與對(duì)照品的峰面積相接近。為了克服薄層板間差異，外標(biāo)法及內(nèi)標(biāo)法均應(yīng)采用隨行標(biāo)準(zhǔn)法，即標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液交叉點(diǎn)在同一塊薄層板上。（2）精密度考察

取同一供試品溶液，在同一塊薄層板上以相同點(diǎn)樣量平行點(diǎn)5點(diǎn)以上，展開后測定其峰面積，求算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD），作為衡量定量分析結(jié)果精密度的指標(biāo)。RSD應(yīng)小于4%。

式中：為n次測量的平均值，S為標(biāo)準(zhǔn)差。（3）準(zhǔn)確度考察

回收率是衡量定量方法準(zhǔn)確度的指標(biāo)，常用加樣回收率（R）來衡量，其值應(yīng)在95-105%之間，測量數(shù)據(jù)一般為5-6個(gè)。將加入純品的試樣溶液、供試品溶液及標(biāo)準(zhǔn)溶液點(diǎn)于同一塊薄層板上，展開后進(jìn)行薄層掃描，測定各斑點(diǎn)的峰面積，計(jì)算各溶液中組分的量，計(jì)算回收率（R）。薄層掃描操作實(shí)例四、氣相色譜法氣相色譜法是以氣體為流動(dòng)相的柱色譜分離分析方法。特點(diǎn)：分離效能高、選擇性好、靈敏度高，樣品用量少及分析速度快等特點(diǎn)，兼具分離、分析的功能適用范圍：適用于熱穩(wěn)定性好的易揮發(fā)性或可轉(zhuǎn)化為易揮發(fā)性組分的分析。

氣相色譜是根據(jù)汽化后的試樣被載氣帶入色譜柱，由于各組分在兩相間作用不同，在色譜柱中移動(dòng)有快慢，經(jīng)一定柱長后得到分離，依次被載氣帶入檢測器，將各組分濃度或質(zhì)量變化轉(zhuǎn)換成電信號(hào)變化記錄成色譜圖，利用色譜峰保留值進(jìn)行定性分析，利用峰面積或峰高進(jìn)行定量分析的方法。（一）基本原理1、塔板理論

將色譜柱的柱效用理論塔板數(shù)n或理論塔板高度H衡量，取決于區(qū)域?qū)挾龋é?、W1/2、W），其計(jì)算公式為n=

=5.54

=16

H=L/n

適中：tR為組分的保留時(shí)間，σ、W1/2、W分別為組分的標(biāo)準(zhǔn)差、半峰寬和基線寬度。速率理論研究了色譜過程中各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)柱效（峰展寬）的影響，提出了VanDeemeter方程式：H=A+B/u+CuA、B/u、Cu分別為渦流擴(kuò)散項(xiàng)、分子擴(kuò)散（縱向擴(kuò)散）項(xiàng)、傳質(zhì)阻抗項(xiàng)，從而解釋了板高隨載氣流速而改變，且有最佳流速（Hmin）的現(xiàn)象。速率方程式對(duì)于色譜分離條件的選擇具有指導(dǎo)意義，它可以說明色譜柱的填充均勻程度、載體粒度、載氣種類、柱溫和固定液膜厚度對(duì)柱效、峰擴(kuò)張的影響。

2、速率理論分離度是衡量分離效果的指標(biāo)，以相鄰兩色譜峰峰尖距對(duì)峰寬均值的倍數(shù)表示，其定義式為：R=1兩峰基本分離，R≥1.5兩峰完全分離。

分離度的影響因素很多，可用基本分離方程式概括如下：a、b、c分別為柱效項(xiàng)，柱選擇性項(xiàng)和柱容量項(xiàng)。R==R=

abc3、分離度的計(jì)算4、系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按藥典標(biāo)準(zhǔn)，中藥制劑分析時(shí)，需按各品種項(xiàng)下要求對(duì)儀器進(jìn)行適用性試驗(yàn)，既用規(guī)定的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行試驗(yàn)和調(diào)整，以達(dá)到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的最小理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子。在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間tR和半峰寬Wh/2，按計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)。若測得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、柱填充等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。

（1）色譜柱的理論板數(shù)n定量分析時(shí)，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其它峰或內(nèi)標(biāo)峰之間有較好的分離度，一般R≥1.5。（2）分離度R取各品種項(xiàng)下的對(duì)照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%，也可按各品種校正因子測定項(xiàng)下，配制相當(dāng)于80%、100%和120%的對(duì)照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別進(jìn)樣3次，計(jì)算平均校正因子，其相對(duì)平均偏差也應(yīng)不大于2.0%。（3）重復(fù)性為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時(shí)，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子T是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定，或不同濃度進(jìn)樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計(jì)算公式為：T=

式中，W0.05h為0.05峰高處的峰寬，d1為峰極大至峰前沿之間的距離，除另有規(guī)定外，T應(yīng)在0.95-1.05之間。（4）拖尾因子T1、固定相的選擇

氣-液色譜①固定液：按極性相似、化學(xué)官能團(tuán)相似的相似性原則和主要差別選擇。②載體：一般為適宜粒度，經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土。氣-固色譜固定相大多采用高分子多孔微球（GDX），用于分離水及含羥基（醇）化合物。（二）實(shí)驗(yàn)條件的選擇沸點(diǎn)300-400℃，采用1-5%低固定液配比，柱溫200-250℃。沸點(diǎn)200-300℃，采用5-10%固定液配比，柱溫150-180℃。沸點(diǎn)100-200℃，采用10-15%固定液配比，柱溫選各組分的平均沸點(diǎn)2/3左右。氣體等低沸點(diǎn)樣品，采用15-25%高固定液配比，柱溫選沸點(diǎn)左右，在室溫或50℃下進(jìn)行分析。對(duì)于寬沸程樣品，需采用程序升溫方法進(jìn)行分析。

但需注意的是柱溫要低于固定液的最高使用溫度。2、柱溫的選擇選擇的基本原則：在使最難分離的組分有符合要求的分離度的前提下，盡可能采用較低柱溫，但以保留時(shí)間適宜及不拖尾為度。在實(shí)際工作中一般根據(jù)樣品的沸點(diǎn)來選擇柱溫，具體有如下幾點(diǎn)：載氣流速較低時(shí)，宜用N2；流速高時(shí)，宜用H2、He；較長色譜柱，宜用H2作載氣；熱導(dǎo)檢測器應(yīng)選用H2、He；氫焰檢測器、電子捕獲檢測器，一般用N2；

一般控制載氣流速高于其最佳流速。常用的載氣流速為

20-80ml/min。3、載氣的選擇主要從對(duì)峰展寬（柱效）、柱壓降和檢測器靈敏度的影響三方面考慮。N2是最常用的載氣熱導(dǎo)檢測器（TCD）：通用型檢測器，應(yīng)用廣泛，但靈敏度較低；

氫焰離子化檢測器（FID）：應(yīng)用最廣泛，適用于含碳有機(jī)物的測定，載氣多為N2。

氮-磷檢測器（NPD）：專屬性檢測器，可用于中藥及其制劑中農(nóng)藥殘留量的檢測。

電子捕獲檢測器（ECD）：專屬性檢測器，適用于痕量電負(fù)性有機(jī)物—如含鹵素、硫、氧、硝基、羰基、氰基等化合物的分析。4、檢測器分類氣化室溫度：一般采用樣品沸點(diǎn)檢測室溫度：通?？筛哂谥鶞?0℃左右或等于氣化室溫度。

進(jìn)樣量：氣體樣品為0.1-1ml液體樣品為0.1-1μl，最大不超過4μl5、其他條件的選擇（三）定量分析方法內(nèi)標(biāo)法外標(biāo)法歸一化法分類

適用范圍：①適用于樣品的所有組分不能全部流出色譜柱②檢測器不能對(duì)每個(gè)組分都產(chǎn)生信號(hào)③只需測定樣品中某幾個(gè)組分含量時(shí)的情況。1、內(nèi)標(biāo)法特點(diǎn)：最常用優(yōu)點(diǎn)：可抵消儀器穩(wěn)定性差、進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確等原因所帶來的定量分析誤差缺點(diǎn)：樣品的配制較麻煩，有些內(nèi)標(biāo)物不易尋找。關(guān)鍵：選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。原理：選擇一內(nèi)標(biāo)物，將一定量的內(nèi)標(biāo)物加入到樣品中，根據(jù)試樣重量W和內(nèi)標(biāo)物重量Ws及待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰而積Ai、As，求出待測組分的含量。待測組分百分含量為：Ci%=式中fi、fs分別為被測組分和內(nèi)標(biāo)的重量校正因子。在中藥制劑分析時(shí)，校正因子經(jīng)常不知，可采用藥典方法測定校正因子再用內(nèi)標(biāo)法，或采用內(nèi)標(biāo)對(duì)比法測定。1）工作曲線法：用一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，在完全相同條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣等體積的樣品溶液，計(jì)算其含量2）外標(biāo)一點(diǎn)法：當(dāng)工作曲線截距為零時(shí)，可采用外標(biāo)一點(diǎn)法定量2、外標(biāo)法①進(jìn)樣量準(zhǔn)確②實(shí)驗(yàn)條件恒定關(guān)鍵分類關(guān)鍵：要求所有組分均要產(chǎn)生色譜峰。適用范圍：通常只能用于粗略考察供試品的雜質(zhì)含量，一般宜用于微量雜質(zhì)的含量檢查。②校正因子相近采用面積歸一化法計(jì)算：3、歸一化法①校正面積歸一化法測定各組分的含量：五、高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）是以經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜的理論和實(shí)驗(yàn)方法。高壓輸送流動(dòng)相，采用高效固定相及在線檢測等手段發(fā)展而來的分離分析方法，具有分離效能高、分析速度快及應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。

適用范圍：適用于極性、非極性化合物，離子型化合物和高分子化合物的分離分析。HPLC與GC的主要差別是流動(dòng)相的性質(zhì)不同。1、塔板理論用于計(jì)算理論塔板數(shù)及理論塔板高度，衡量色譜柱的柱效。在系統(tǒng)適用性試驗(yàn)中，其理論板數(shù)不得低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)。

H=L/n（一）HPLC的基本原理在HPLC中流動(dòng)相為液體。粘度大柱溫低，擴(kuò)散系數(shù)Dm很小，因此縱向擴(kuò)散項(xiàng)B/u可忽略不計(jì)，其速率方程式為：H=A+CuC=Cm+Csm+Cs式中Cm、Csm、Cs分別是組分在流動(dòng)相、靜態(tài)流動(dòng)相和固定相中的傳質(zhì)阻抗系數(shù)。對(duì)于化學(xué)鍵合相色譜，“固定液”是被鍵合在載體表面的單分子層，Cs≈0，則C=Cm+Csm。在HPLC中，當(dāng)流動(dòng)相的線速度大于1cm/s時(shí)，可近似認(rèn)為流動(dòng)相的流速與板高成直線關(guān)系，為兼顧柱效與分析速度，一般都采用較低流速。內(nèi)徑2-4.6mm的色譜柱，多采用1ml/min。2、速率理論①大多數(shù)藥物可用C18反相（ODS）柱加以分離測定；②也可選用正相分配色譜柱（氨基柱、氰基柱）或硅膠吸附色譜柱等；③解離藥物可用離子對(duì)色譜、離子抑制色譜或離子交換色譜分離測定；④脂溶性藥物異構(gòu)體的分離測定可采用硅膠吸附色譜柱。（二）HPLC實(shí)驗(yàn)條件的選擇1、色譜柱的選擇根據(jù)被分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解度等因素進(jìn)行選擇。反相鍵合相色譜流動(dòng)相常用溶劑適用范圍部分含水溶劑甲醇-水、乙腈-水系統(tǒng)用于分離中等極性、弱極性藥物非水溶劑乙腈-二氯甲烷、甲醇-四氫呋喃等用于分離疏水性物質(zhì)緩沖溶液三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液用于可溶于水并具可解離特性的化合物2、流動(dòng)相的選擇

①常采用飽和烷烴（如正已烷）中加入一種極性較大的溶劑作為極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醚），通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度改變?nèi)軇?qiáng)度；

②常采用二元以上的混合溶劑系統(tǒng)。正相鍵合相色譜①流動(dòng)相：極性較強(qiáng)的水系統(tǒng)混合溶劑；②常用溶劑：甲醇-水、乙腈-水中加0.003~0.01mol/L的離子對(duì)試劑。③影響因素：離子對(duì)試劑的性質(zhì)和濃度；流動(dòng)相中有機(jī)溶劑的性質(zhì)和比例。反相離子對(duì)色譜等度洗脫流動(dòng)相的組成保持恒定適用于組分?jǐn)?shù)少、性質(zhì)差別不大的樣品。

梯度洗脫程序控制流動(dòng)相的組成（如溶劑極性、離子強(qiáng)度和pH值等）適用于組分?jǐn)?shù)多、性質(zhì)相差較大的復(fù)雜混合物樣品。3、洗脫方式4、檢測器

紫外檢測器（①可變波長型；②二極管陣列）特點(diǎn)：靈敏度較高，噪音低，線性范圍寬，對(duì)流速和溫度波動(dòng)不靈敏，可用于梯度洗脫。熒光檢測器（FD）特點(diǎn)：用于能產(chǎn)生熒光或其衍生物能發(fā)熒光的物質(zhì)，靈敏度高于紫外檢測器。電化學(xué)檢測器（ECD）特點(diǎn)：用于能氧化、還原的有機(jī)物質(zhì)的檢測。蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）特點(diǎn)：屬通用型檢測器，理論上可用于揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品組分，檢測靈敏度較低，適用于流動(dòng)相能揮發(fā)的色譜洗脫，不能用含緩沖鹽的流動(dòng)相。示差折光檢測器（RID）特點(diǎn)：①屬通用型檢測器，利用組分與流動(dòng)相折射率之差進(jìn)行檢測。②穩(wěn)定性好，操作方便。③靈敏度低、受環(huán)境溫度、流動(dòng)相組成等波動(dòng)的影響大，不適合梯度洗脫。①溶劑的純化

選擇“色譜純”溶劑

水一般采用石英系統(tǒng)二次蒸餾水5、HPLC前處理流動(dòng)相的處理②流動(dòng)相脫氣HPLC所用的流動(dòng)相必須預(yù)先除去其中的空氣超聲波振蕩脫氣惰性氣體（He）鼓泡吹掃脫氣抽真空加熱法。③過濾過濾是為了防止不溶物堵塞流路和色譜柱入口處的微孔墊片，采用0.45μm以下微孔濾膜過濾。

濾膜分有機(jī)溶劑專用和水溶液專用兩種。常用的脫氣法①待測組分的提取根據(jù)樣品成分及組分性質(zhì)選擇合適的提取方法和提取條件。自然揮散，適用于小體積樣品和揮發(fā)性溶劑；減壓蒸發(fā)，適用于熱不穩(wěn)定樣品；冷凍干燥，適用于受熱易分解破壞的樣品。③濾過樣品溶液進(jìn)樣前，需用濾膜抽濾或針頭濾器過濾，以有效除去樣品溶液中的懸浮物或部分大分子雜質(zhì)。（0.45μm）②溶劑的揮發(fā)樣品的處理（三）定量分析方法HPLC法多采用紫外檢測器，定量分析方法可采用外標(biāo)一點(diǎn)法。紫外檢測器靈敏度高，待測組分濃度低，標(biāo)準(zhǔn)曲線過原點(diǎn)。進(jìn)樣器有定量環(huán)，無需準(zhǔn)確進(jìn)樣，可消除進(jìn)樣誤差。操作實(shí)例六、原子吸收分光光度法測定幾乎全部金屬元素和一些半金屬元素，已廣泛應(yīng)用于中藥制劑及中藥材中重金屬、毒害元素及微量元素的檢測。優(yōu)點(diǎn)靈敏度高選擇性和重現(xiàn)性好干擾較少操作簡便快速測定范圍廣

缺點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性范圍窄測定不同元素一般需用不同光源燈實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格原子吸收分光光度法是基于從光源輻射出具有待測元素特征譜線的光，通過試樣蒸氣時(shí)被待測元素的基態(tài)原子所吸收，由輻射譜線被減弱的程度（即原子的吸光度）來測定試樣中該元素的含量。(一)基本原理（二）定量分析方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法、標(biāo)準(zhǔn)加入法、內(nèi)標(biāo)法A濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線法待測元素S的濃度內(nèi)標(biāo)法加入的對(duì)照品濃度標(biāo)準(zhǔn)加入法-aAAs/Aiaa（三）樣品的處理被測樣品溶液樣品分解1.無機(jī)試樣：分解試樣（1）酸溶解；（2）堿熔融；（3）微波溶樣法。2.有機(jī)試樣：消化處理后再分解（1）干法消化；（2）濕法消化。準(zhǔn)確稱取一定量的樣品，置于石英坩鍋或鉑坩鍋中，于80~150℃低溫加熱趕去大量有機(jī)物；然后放于高溫爐中，加熱至450~550℃進(jìn)行灰化處理。冷卻后，再將灰分用HNO3、HCl或其它溶劑進(jìn)行溶解。如有必要，可加熱溶液以使殘?jiān)芙馔耆詈筠D(zhuǎn)移到容量瓶中，稀釋溶液至刻度。樣品坩堝（80-150度加熱）高溫爐（450-550度灰化）硝酸、鹽酸或其他溶劑冷卻后干法消化:在較高的溫度下，用氧來氧化樣品。

若使用石墨爐原子化器，則可直接分析固體試樣。濕法消化:在樣品升溫下用合適的酸加以氧化。HCl+HNO3HNO3+HClO4H2SO4+HNO3若用微波溶樣技術(shù)，可將樣品放于聚四氟乙烯燜罐中，于專用微波爐中加熱消化樣品。根據(jù)樣品類型決定采用何種混酸消化樣品。第四節(jié)含量測定方法的效能指標(biāo)

任何一種分析方法，根據(jù)其使用對(duì)象和要求，都應(yīng)有相應(yīng)的效能指標(biāo)。分析方法的效能指標(biāo)可以作為對(duì)分析方法的評(píng)估尺度，也可作為建立新的分析方法的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。常用的效能評(píng)價(jià)指標(biāo)有：準(zhǔn)確度、精密度、選擇性、檢測限、定量限、線性與范圍、耐用性等。一般以回收率（%）表示。準(zhǔn)