水產(chǎn)品一般成分的檢測-蛋白質(zhì)的測定

蛋白質(zhì)測定的主要方法及原理概述一凱式定氮法的原理二乙酰丙酮比色法的原理三目錄頁燃燒法的原理四雙縮脲法的原理五福林酚法的原理六

蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命組成重要物質(zhì)，是由氨基酸之間脫水縮合形成的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子有機(jī)物。

食品中蛋白質(zhì)是人體重要的營養(yǎng)物質(zhì)和食品營養(yǎng)指標(biāo)。對其含量進(jìn)行測定有利于合理開發(fā)利用食品資源，優(yōu)化食品配方、控制生產(chǎn)過程、提高和監(jiān)督產(chǎn)品質(zhì)量。一、概述

蛋白質(zhì)的測定按其原理可大致分為兩大類：1.通過測定含氮量換算出樣品蛋白質(zhì)含量。如凱式定氮法、燃燒法等。2.利用蛋白質(zhì)組成中特定氨基酸殘基、酸性或堿性基團(tuán)、芳香基團(tuán)的含量，測定蛋白質(zhì)含量。如紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍(lán)法、福林酚法等。

國標(biāo)GB5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中采用了三種方法，凱式定氮法、分光光度法和燃燒法。

蛋白質(zhì)測定方法測定方法二、凱式定氮法的原理

蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。樣品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。

在凱氏定氮器中與堿作用，通過蒸餾釋放出氨氣，收集于硼酸溶液中。用已知濃度的H2SO4(或HCI)標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸消耗的量計(jì)算出氮的含量，然后乘以相應(yīng)的換算因子，既得蛋白質(zhì)的含量。

食品中除蛋白質(zhì)外，還含有其他含氮物質(zhì)，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。二、凱式定氮法的原理消化爐自動凱式定氮儀二、凱式定氮法的原理

優(yōu)點(diǎn)

重現(xiàn)性好，應(yīng)用范圍廣，是目前分析有機(jī)化合物含氮量常用的方法，是蛋白質(zhì)測定經(jīng)典方法，測試結(jié)果準(zhǔn)確。

缺點(diǎn)

操作比較繁復(fù)，費(fèi)時(shí)，試劑消耗量大。

局限于樣品中總蛋白質(zhì)的檢測，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，易受到被測樣品中其它有機(jī)含氮化合物（如核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉、含氮色素等）的干擾。三、乙酰丙酮比色法的原理

樣品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。在pH4.8的乙酸鈉一乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm下測定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，計(jì)算出氮的含量，再乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

該方法適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測定，不僅能滿足對工藝過程的快速控制分析，而且具有環(huán)境污染小，操作簡便省時(shí)等特點(diǎn)。四、燃燒法的原理

將試樣在900℃~1200℃高溫下燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體。其中的碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮?dú)?，形成的氮?dú)鈿饬魍ㄟ^熱導(dǎo)檢測器(TCD)進(jìn)行檢測。計(jì)算出氮的含量，再乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。

該方法需使用氮/蛋白質(zhì)分析儀進(jìn)行測定，適用于蛋白質(zhì)含量在10g/100g以上的糧食、豆類奶粉、米粉、蛋白質(zhì)粉等固體試樣的測定。五、雙縮脲法的原理蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上的肽鍵，故有雙縮脲反應(yīng)。在堿性條件下，肽鍵的質(zhì)子被解離，二價(jià)銅離子和失去質(zhì)子的多肽鏈的氮相結(jié)合產(chǎn)生穩(wěn)定的紫色絡(luò)合物，在540-560nm的光吸收值與蛋白質(zhì)的含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

紫色絡(luò)合物+雙縮脲試劑五、雙縮脲法的原理

由于與雙縮脲試劑與不同種類的蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的顏色差別極小，使得該方法比較適合總蛋白質(zhì)的測定。

該方法的優(yōu)點(diǎn)為操作簡單、測量速度快。缺點(diǎn)為靈敏度較差，精度不高。六、福林酚法的原理1.在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；2.是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑(Folin-酚試劑)還原，產(chǎn)生深藍(lán)色(磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物)，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。六、福林酚法的原理

優(yōu)點(diǎn)

反應(yīng)靈敏，檢測限低，比較適合微量蛋白質(zhì)的測定。

缺點(diǎn)

福林酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，因而要求精確控制操作時(shí)間，且容易受到酚類、糖類、尿素等多種物質(zhì)的干擾。

不同蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量不同，導(dǎo)致在不知道蛋白質(zhì)種類的情況下測量結(jié)果存在部分偏差。水產(chǎn)品蛋白質(zhì)的測定——凱式定氮法概述一原理二試劑與儀器三目錄頁分析步驟四注意事項(xiàng)五

凱氏定氮法是由丹麥化學(xué)家凱.道爾于1833年建立的，現(xiàn)已發(fā)展為常量、微量、半微量凱氏定氮法以及自動定氮儀法等，是分析有機(jī)化合物含氮量的常用方法。

一、概述二、原理

凱氏定氮法的理論基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)中的含氮量通常占其總質(zhì)量的16%左右，因此，通過測定物質(zhì)中的含氮量便可估算出物質(zhì)中的總蛋白質(zhì)含量(假設(shè)測定物質(zhì)中的氮全來自蛋白質(zhì))，即：=N×6.25=蛋白質(zhì)含量二、原理

蛋白質(zhì)與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，并換算成蛋白質(zhì)含量。三、試劑與儀器試劑

硫酸銅、硫酸鉀、400g/L氫氧化鈉溶液、0.0500mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、20g/L硼酸溶液、混合指示液A（2份1g/L甲基紅乙醇溶液與1份1g/L亞甲基藍(lán)乙醇溶液臨用時(shí)混合）、混合指示液B（1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時(shí)混合）儀器

分析天平、凱氏定氮裝置或自動凱氏定氮儀、酸式滴定管、鐵架臺等

四、分析步驟1.樣品處理

稱取充分混勻的固體試樣0.2g~2g、半固體試樣2g~5g或液體試樣10g~25g(約當(dāng)于30mg~40mg氮)，精確至0.001g。

消化

將樣品移入干燥的定氮瓶或消化管中，加入0.4g硫酸銅、6g硫酸鉀及20mL濃硫酸，輕搖后小心加熱，待內(nèi)容物全部碳化，泡沫完全停止后，加強(qiáng)火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色并澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h~1h。

取下放冷，小心加入20mL水，放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度,混勻備用。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。四、分析步驟

2.蒸餾

裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水至2/3處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器內(nèi)的水并保持沸騰。

四、分析步驟2.蒸餾

向接受瓶內(nèi)加入10.0mL硼酸溶液及1滴~2滴混合指示劑，并使冷凝管的下端插入液面下。根據(jù)試樣中氮含量，準(zhǔn)確吸取2.0mL~10.0mL試樣處理液由小玻杯注入反應(yīng)室，以10mL水洗滌小玻杯并使之流入反應(yīng)室內(nèi)，隨后塞緊棒狀玻塞。將10.0mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應(yīng)室，立即將玻塞蓋緊，并水封。夾緊螺旋夾,開始蒸餾。蒸餾10min后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾1min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。四、分析步驟3.滴定

盡快以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至終點(diǎn),如用A混合指示液,終點(diǎn)顏色為灰藍(lán)色;如用B混合指示液,終點(diǎn)顏色為淺灰紅色。同時(shí)做試劑空白。

如使用自動凱氏定氮儀，消化完成后，消化管冷卻后加入50mL水,于自動凱氏定氮儀上實(shí)現(xiàn)自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數(shù)據(jù)的過程。結(jié)果的計(jì)算試樣中蛋白質(zhì)的含量按下式計(jì)算：

式中：

X——試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為g/100gV1——試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為ml；V2——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為ml；c——硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為mol/L；0.0140——1.0mL硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量m——試樣的質(zhì)量，單位為g；

V3——吸取消化液的體積，單位為ml；F——氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，各種食品中氮轉(zhuǎn)換系數(shù)見標(biāo)準(zhǔn)附錄A100——換算系數(shù)五、注意事項(xiàng)

加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點(diǎn)，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時(shí)作堿性反應(yīng)的指示劑。