羥苯磺酸鈣對(duì)硒性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

羥苯磺酸鈣對(duì)硒性白內(nèi)障大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

盲性障礙是世界上最常見的盲性疾病。隨著人口的老齡化，相關(guān)的年齡障礙逐漸成為主要的障礙之一。預(yù)防和治療已成為全世界的公共健康問題之一。1材料和方法1.1材料表面1.1.1醫(yī)藥濃度測(cè)量健康雄性SD大鼠138只,SPF級(jí),10日齡,體重(30±2)g,廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(粵)-2013-0002。所有大鼠均于本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水、飲食,術(shù)前12h禁食不禁水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7日,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用均遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。1.1.2細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑羥苯磺酸鈣分散片(批號(hào):H20130288),購(gòu)自江蘇萬高藥業(yè)有限公司;維生素C注射液(批號(hào):H41023858-2ml︰0.5mg),購(gòu)自河南天方藥業(yè)有限公司;亞硒酸鈉(批號(hào):S5261),購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、戊二醛、BCA試劑盒、蛋白抽提試劑盒購(gòu)自碧云天公司;4%多聚甲醛、戊巴比妥鈉、HE染色試劑盒,購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司;DAB顯色試劑盒,購(gòu)自中杉金橋公司;Anticaspase3、Anti-Bcl-2、Anti-Bax、Anti-Nrf2、AntiKeap1、Anti-HO-1、Anti-GAPDH,購(gòu)自美國(guó)CST公司;AU5800全自動(dòng)生化檢測(cè)儀,購(gòu)自美國(guó)BeckmanCoulter公司;KJ5S3手持裂隙燈顯微鏡,購(gòu)自蘇州康捷醫(yī)療有限公司;蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀,美國(guó)Bio-Rad公司;光學(xué)顯微鏡,日本Olympus公司;石蠟烤片機(jī)、切片機(jī)等,德國(guó)Leica公司等。1.2方法1.2.1各組大鼠輸注后實(shí)驗(yàn)分組:按照隨機(jī)數(shù)表法將138只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、維生素C組、羥苯磺酸鈣低、中、高劑量組,每組23只。模型制備:參照文獻(xiàn)中方法采用小劑量隔日注射亞硒酸鈉法制備硒性白內(nèi)障模型大鼠1.2.2各組均質(zhì)結(jié)晶污染檢測(cè)連續(xù)用藥4周后,采用裂隙燈顯微鏡對(duì)所有大鼠晶狀體混濁情況進(jìn)行檢測(cè),參照Bahmani等的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)晶狀體混濁情況進(jìn)行分級(jí)1.2.3大鼠國(guó)氮中人工酶活性的測(cè)定連續(xù)用藥4周后,采用戊巴比妥鈉麻醉后處死各大鼠,取各大鼠晶狀體,洗凈后分為二份,一份在液氮中速凍后,置于-80℃保存;一份置于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)制備石蠟切片。1.2.4脫蠟、水化處理對(duì)1.2.3中大鼠晶狀體組織切片進(jìn)行脫蠟、水化處理。按照HE法染色流程對(duì)切片逐步進(jìn)行染色,封片后置于光學(xué)顯微鏡下,觀察大鼠晶狀體組織形態(tài)并拍照。1.2.5tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)對(duì)1.2.3大鼠晶狀體組織切片行常規(guī)脫蠟、水化處理后,加入ProteinaseK(20μg/ml)工作液,室溫條件下孵育30min。然后,嚴(yán)格按照Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作;加入0.05%DAB溶液,室溫顯色3min;甲基綠復(fù)染,脫水、封片固定。置于光學(xué)顯微鏡下,觀察并計(jì)數(shù)染色陽性的細(xì)胞數(shù)量,每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。細(xì)胞凋亡指數(shù)(%)=染色陽性細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量×100%。1.2.6總蛋白的提取將1.2.3中大鼠晶狀體冷凍組織在液氮中研磨,加入1.5ml蛋白裂解液(含proteaseinhibitor),采用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白,采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白總量。SDS-凝膠電泳后,半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上;5%脫脂奶粉,封閉1h;分別加入一抗Anti-caspase3、AntiBcl-2、Anti-Bax、Anti-Nrf2、Anti-Keap1、Anti-HO-1、Anti-GAPDH(1︰500),4℃孵育過夜;加入二抗(1︰5000),室溫孵育1h。經(jīng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè),Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行半定量分析。1.3kruskal-培養(yǎng)了多組間眼數(shù)差異的表采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,大鼠晶狀體混濁程度的數(shù)據(jù)采用頻數(shù)表示,多組間眼數(shù)的差異比較行Kruskal-WallisH檢驗(yàn);計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,行單因素方差分析,兩兩比較行t檢驗(yàn)。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1各組大鼠結(jié)晶混合度的比較與對(duì)照組比較,模型組大鼠的晶狀體混濁程度顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2.2大鼠布氏細(xì)胞的變化對(duì)照組大鼠晶狀體組織結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞排列整齊,分布均勻,形態(tài)規(guī)則;與對(duì)照組比較,模型組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞排列紊亂,分布疏松,出現(xiàn)大量空泡,晶狀體纖維細(xì)胞斷裂,降解;與模型組比較,羥苯磺酸鈣低、中、高劑量組大鼠晶狀體組織病理損傷程度均減輕。見圖1。2.3%p與對(duì)照組比較,模型組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.710,P<0.05);與模型組比較,維生素C組、羥苯磺酸鈣低、中、高劑量組大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低(t=3.227~16.107,P<0.05),且呈劑量依賴性(t=5.307~14.354,P<0.05)。見圖2、表2。2.4各組大鼠臟器中bcl-2、bax、caspase3蛋白水平比較與對(duì)照組比較,模型組大鼠晶狀體組織中Bcl-2蛋白水平顯著下降(t=3.943,P<0.05),Bax、Caspase3蛋白水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.108,t=16.438,P<0.05);與模型組比較,維生素C組、羥苯磺酸鈣低、中、高劑量組大鼠晶狀體組織中Bcl-2蛋白水平明顯升高,Bax、Caspase3蛋白水平明顯降低(t=2.486~15.790,P<0.05),且呈劑量依賴性(t=3.599~18.166,P<0.05)。見圖3、表3。2.5各組大鼠臟器nrf2蛋白表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較,模型組大鼠晶狀體組織細(xì)胞核中Nrf2蛋白水平明顯升高,細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白水平顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.064,t=14.033,P<0.05);與模型組比較,維生素C組、羥苯磺酸鈣低、中、高劑量組大鼠晶狀體組織細(xì)胞核Nrf2蛋白水平顯著降低(t=5.861~18.623,P<0.05),細(xì)胞質(zhì)中Nrf2蛋白水平顯著升高(t=6.197~12.563,P<0.05),且呈劑量依賴性(t=5.359~16.860,P<0.05)。與對(duì)照組比較,模型組大鼠晶狀體組織中Keap1、HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.502,t=17.313,P<0.05);與模型組比較,維生素C組、羥苯磺酸鈣低、中、高劑量組大鼠晶狀體組織中Keap1、HO-1蛋白表達(dá)水平明顯降低(t=5.835~14.882,P<0.05),且呈劑量依賴性(t=6.169~16.081,P<0.05)。見圖4、表4。3齡相關(guān)性含油劑氧化應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡硒性白內(nèi)障大鼠是研究年齡相關(guān)性白內(nèi)障疾病發(fā)生機(jī)制及白內(nèi)障治療方法的一種常用動(dòng)物模型年齡相關(guān)性白內(nèi)障疾病的發(fā)生有多種機(jī)制參與,目前主要認(rèn)為氧化應(yīng)激