2021年結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物臨床檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)(完整版)

2021年結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物臨床檢測(cè)中國(guó)專家共識(shí)（完整版）摘要結(jié)直腸癌是目前我國(guó)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療理念及對(duì)腫瘤相關(guān)分子標(biāo)志物硏究的逐年深入，合理的檢測(cè)及應(yīng)用結(jié)直腸癌相關(guān)分子標(biāo)志物已經(jīng)成為目前臨床實(shí)踐的重要部分。為了提高臨床醫(yī)師對(duì)結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物的了解及應(yīng)用，中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)（CSCO）結(jié)直腸癌專家委員會(huì)組織相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜?，根?jù)近年的國(guó)內(nèi)外臨床硏究及實(shí)際診療經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)專家組反復(fù)修改討論，撰寫了結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物臨床檢測(cè)的專家共識(shí)，旨在為臨床醫(yī)師提供參考及指導(dǎo)，為結(jié)直腸癌患者提供更加精準(zhǔn)、有效的治療。結(jié)直腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，死亡率居第2位。在我國(guó)，結(jié)直腸癌發(fā)病率亦呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。根據(jù)2019年國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)顯示，2015年中國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例38.8萬(wàn)，死亡病例18.7萬(wàn)⑴。結(jié)直腸癌的早期篩查及預(yù)防可以降低發(fā)病率、提高治愈率，相關(guān)分子標(biāo)志物的檢測(cè)是結(jié)直腸癌篩查的有效補(bǔ)充，同時(shí)對(duì)個(gè)體化方案的判定、預(yù)后判斷及療效預(yù)測(cè)等方面起到重要作用。本共識(shí)綜合國(guó)內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜遗R床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)及國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的硏究成果，旨在為結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物的臨床檢測(cè)及臨床實(shí)踐提供規(guī)范及指導(dǎo)。

本共識(shí)對(duì)結(jié)直腸癌治療中與方案選擇和預(yù)后判斷有關(guān)的分子標(biāo)志物的檢測(cè)標(biāo)本、檢測(cè)方法以及檢測(cè)結(jié)果的解讀提供了指導(dǎo)意見。其中每個(gè)分子標(biāo)志物檢測(cè)的適應(yīng)證和時(shí)機(jī)見圖1。MSVMMR■8RAFV600ERAS■(MSVMMR■8RAFV600ERAS■(APC/MMR/STK11#)遙傳性疾角(FAP、林荀綿臺(tái)征,PJ綜合征需)/韶MRBRAFVGOOE注:FiP:克妄性鈿經(jīng)旦毛反-FM謀含飪:三斑黑南疥r/MR臣目矣套樂云-MET:②匹不電宜圖1結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物檢測(cè)的適應(yīng)證與時(shí)機(jī)一、檢測(cè)標(biāo)本目前在臨床中，用于結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物檢測(cè)的標(biāo)本來源主要為患者的腫瘤組織標(biāo)本以及外周血標(biāo)本，其中外周血標(biāo)本又涵蓋了外周血有核細(xì)胞、血液無(wú)細(xì)胞液體成分及循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcell，CTC)。腫瘤組織檢測(cè)可反映腫瘤的體細(xì)胞突變，而外周血標(biāo)本中，血有核細(xì)胞的基因檢測(cè)代表患者的胚系突變，CTC基因檢測(cè)代表的是腫瘤的體細(xì)胞突變，而血液無(wú)細(xì)胞液體成分中的循環(huán)無(wú)細(xì)胞DNA(circulatingfreeDNA，cfDNA)既可能源自腫瘤細(xì)胞，也可能源自血有核細(xì)胞［2］。1?腫瘤組織標(biāo)本：腫瘤組織標(biāo)本中具有較富集的腫瘤細(xì)胞，可更真實(shí)地反映腫瘤中基因的變異情況，但由于無(wú)法區(qū)分突變是體細(xì)胞突變還是胚系突變，因此不能用于遺傳性疾病如林奇綜合征的診斷。腫瘤組織樣本又可根據(jù)其來源分為原發(fā)灶樣本和轉(zhuǎn)移灶樣本。對(duì)于結(jié)直腸癌相關(guān)KRAS、NRAS和BRAF基因的突變，在原發(fā)灶樣本和轉(zhuǎn)移灶樣本中的一致性非常高。2?外周血標(biāo)本：外周血有核細(xì)胞標(biāo)本能明確反映胚系突變情況，可用于遺傳性患者的診斷。但外周血有核細(xì)胞不能反映腫瘤組織的體細(xì)胞突變，無(wú)法幫助臨床預(yù)測(cè)相關(guān)藥物的治療效果。外周血有核細(xì)胞標(biāo)本基因檢測(cè)時(shí)要注意CTC可能帶來的干擾。轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastaticcolorectalcancer，mCRC)既往的基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法是組織活檢，但存在若干缺點(diǎn)，包括人體侵入性、獲得樣本的技術(shù)難度較高等。近年來，微侵入性的液體活檢技術(shù)顯示出良好的應(yīng)用前景。對(duì)外周血進(jìn)行分離純化后可以檢測(cè)CTC或者cfDNA。cfDNA是指游離于血液中的細(xì)胞夕卜DNA，主要來源于衰老、凋亡的血細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放的片段化DNA，因此可以表達(dá)來自腫瘤的DNA。循環(huán)腫瘤DNA(circulatingtumorDNA,ctDNA)是腫瘤細(xì)胞凋亡后進(jìn)入血液的游離DNA，是cfDNA的一種，其監(jiān)測(cè)或能更早地預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)［3,4］；為術(shù)前新輔助治療及術(shù)后輔助治療的療效評(píng)估提供參考［567］。但目前尚缺乏特異性驗(yàn)證和可靠的重復(fù)試驗(yàn)。目前，cfDNA的液體活檢仍處于探索階段，尚存在較多問題和挑戰(zhàn)。外周血中ctDNA的含量較低，分離和純化ctDNA具有一定難度，ctDNA在cfDNA中的占比較小，正常血細(xì)胞來源的DNA同樣會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成干擾。cfDNA在血液中的半衰期僅1.0?2.4h，因此標(biāo)本的取樣、制備和存儲(chǔ)等環(huán)節(jié)均有較高難度，極易造成結(jié)果不準(zhǔn)確。此外，樣本較易受到外部因素影響而不能正確反映患者腫瘤中的突變情況。因此，目前cfDNA液體活檢僅推薦作為臨床硏究探索性應(yīng)用。此外，CTC也是外周血標(biāo)本中的重要部分。CTC是從原發(fā)或繼發(fā)腫瘤脫落進(jìn)入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。因循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞分布相對(duì)稀少，CTC的檢測(cè)過程主要分為兩步，即細(xì)胞的分離富集和富集細(xì)胞的鑒定。目前，CTC及相關(guān)分子標(biāo)志物檢測(cè)的臨床應(yīng)用仍在探索中，可能對(duì)于疾病的早期篩查、預(yù)后判斷和療效評(píng)估有一定作用［4］。二、檢測(cè)方法目前,分子標(biāo)志物的檢測(cè)方法包括免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry」HC)、熒光原位雜交技術(shù)(fluorescenceinsituhybridization,FISH)和基因測(cè)序等。不同類型的標(biāo)本和變異需要選擇不同的檢測(cè)方法。IHC操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，目前已在臨床廣泛使用。它主要用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)，但不能反映基因變異情況，目前只用于篩查。FISH在臨床中廣泛用于基因擴(kuò)增、缺失及倒位異位的檢測(cè)?；驕y(cè)序方法中，Sanger測(cè)序法及熒光定量PCR費(fèi)用適中，是臨床檢測(cè)中用于檢測(cè)基因變異的傳統(tǒng)技術(shù)，但只能檢查一個(gè)基因特定范圍內(nèi)的突變，目前是在結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物檢測(cè)中使用最多的檢測(cè)方法。第2代測(cè)序(next-generationsequencing，NGS)因其檢測(cè)的高通量，一次檢測(cè)可以包含幾十個(gè)、上百個(gè)甚至整個(gè)基因組的變異情況，對(duì)于需要同時(shí)檢測(cè)很多個(gè)基因、但樣本量又有限的病例，具有較大優(yōu)勢(shì)。隨著對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的深入硏究和基因檢測(cè)能力的提高，與結(jié)直腸癌發(fā)病和治療相關(guān)的基因越來越多。目前，國(guó)內(nèi)外已有的相關(guān)指南及實(shí)踐推薦檢測(cè)的結(jié)直腸癌相關(guān)基因包括APC、MMR、RAS和BRAF等。與此同時(shí)，對(duì)于其他一些具有潛在臨床意義的基因也得到越來越多的關(guān)注，包括Her-2擴(kuò)增/過表達(dá)、PIK3CA突變和NTRK融合等。常規(guī)分子標(biāo)志物檢測(cè)1.RAS基因點(diǎn)突變：KRAS和NRAS是由RAS家族成員基因編碼的兩種GTP酶蛋白，參與表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖和存活。40%?50%的結(jié)直腸癌患者存在KRAS點(diǎn)突變［8］;3.8%的結(jié)直腸癌存在NRAS基因點(diǎn)突變［9］。需要檢測(cè)的位點(diǎn)包括KRAS和NRAS基因的第2、3、4號(hào)外顯子。RAS點(diǎn)突變可以采用的檢測(cè)方法包括：Sanger測(cè)序法、PCR和NGS。當(dāng)可以得到腫瘤細(xì)胞較為豐富的結(jié)直腸癌組織標(biāo)本時(shí)，RAS點(diǎn)突變可以使用Sanger測(cè)序法，其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)設(shè)備要求低，價(jià)格便宜。此外，因?yàn)镽AS突變是已知位點(diǎn)和已知突變類型，因此，也可以通過設(shè)計(jì)引物和探針進(jìn)行PCR檢測(cè)，是目前運(yùn)用最普遍的檢測(cè)方法。根據(jù)目前現(xiàn)有指南及臨床實(shí)踐，推薦以5%作為組織學(xué)的RAS基因檢測(cè)的突變豐度截?cái)嘀担?0］。目前已有多項(xiàng)臨床硏究表明，RAS野生型的晚期結(jié)直腸癌患者能從抗EGFR單抗治療中獲益，患者的總生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)［11,12,13］。尤其對(duì)于原發(fā)灶位于左半結(jié)腸和直腸的患者，接受化療聯(lián)合抗EGFR單抗治療的患者中位總生存期可達(dá)到55個(gè)月以上［14］。因此，對(duì)于這部分患者推薦首選化療聯(lián)合抗EGFR單抗的治療方案［11,12］。而對(duì)于RAS基因突變患者，應(yīng)用抗EGFR單抗則無(wú)明確獲益，一般采用化療聯(lián)合VEGF單抗治療。因此，推薦在mCRC患者開始治療前，應(yīng)進(jìn)行RAS突變的檢測(cè)，有助于幫助患者選擇最佳的個(gè)體化治療方案。2?BRAF基因點(diǎn)突變：BRAF基因作為RAF原癌基因家族的成員，位于RAS基因下游，是RAS-RAF-MEK激酶通路上的關(guān)鍵成員。在亞洲結(jié)直腸癌患者中，BRAF突變率為5.4%?6.7%［15］。另有硏究顯示，BRAF基因突變的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，90%為BRAFV600E突變［16］。與RAS點(diǎn)突變相似，BRAF突變可以采用的檢測(cè)方法也包括：Sanger測(cè)序法、PCR和NGS。目前運(yùn)用最普遍的也是PCR檢測(cè)。NCCN指南和CSCO指南對(duì)BRAFV600E突變mCRC患者的二線治療均推薦西妥昔單抗+伊立替康+維莫非尼（BRAF抑制劑），或者西妥昔單抗+BRAF抑制劑士MEK抑制劑的聯(lián)合方案［17,18］。BRAF基因狀態(tài)對(duì)結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評(píng)估也具有指導(dǎo)意義［18,19,20］。BRAFV600E突變患者相比其他患者預(yù)后更差，生存時(shí)間更短［21］。另外，對(duì)于林奇綜合征的診斷，MLH1突變患者必須加做MLH1甲基化或BRAFV600E突變檢測(cè)，如有BRAFV600E突變則不能確診為林奇綜合征。因此，推薦在結(jié)直腸癌患者中進(jìn)行BRAFV600E突變檢測(cè)，可用于選擇個(gè)體化治療方案、幫助林奇綜合征的診斷以及患者的預(yù)后判斷。3?微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatelliteinstability,MSI)狀態(tài)和錯(cuò)配修復(fù)(mismatchrepair,MMR)蛋白表達(dá)：MSI狀態(tài)和MMR蛋白表達(dá)是包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的泛瘤種免疫檢查點(diǎn)抑制劑效果的預(yù)測(cè)指標(biāo)［22,23,24］。對(duì)于MSI檢測(cè)，目前主要以多重?zé)晒釶CR毛細(xì)管電泳技術(shù)為主。對(duì)相關(guān)細(xì)胞DNA微衛(wèi)星的長(zhǎng)度改變來決定MSI狀況。根據(jù)微衛(wèi)星的不同狀況可將患者分為3種，即：高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-H）、低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI-L）和微衛(wèi)星穩(wěn)定（micro-satellitestable，MSS）。通常采用美國(guó)國(guó)家癌癥硏究所推薦的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)n2個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)顯示MSI,即可診斷為MSI-H;1個(gè)顯示MSI，可診斷為MSI-L;沒有任何位點(diǎn)顯示MSI，即MSS[25]。MMR蛋白的IHC檢測(cè)，需同時(shí)檢測(cè)4個(gè)常見MMR蛋白（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）的表達(dá)。其中A1種表達(dá)缺失，判定為錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷（dMMR）；全部陽(yáng)性，則判定為錯(cuò)配修復(fù)基因完整（pMMR）。一般而言，dMMR相當(dāng)于MSI-H,pMMR相當(dāng)于MSI-L或MSS。MSI-H狀態(tài)的口期和皿期結(jié)直腸癌患者，其預(yù)后一般優(yōu)于MSS患者。MSI-H的口期患者，一般預(yù)后較好，且不能從氟尿嘧啶（5-FU）類單藥化療中獲益，所以建議口期患者術(shù)后常規(guī)進(jìn)行MSI檢測(cè)。此外，轉(zhuǎn)移性MSI-H/dMMR患者對(duì)于免疫檢查點(diǎn)抑制劑療效較好。Checkmate142硏究表明,納武單抗有效率為31%[26]。而非MSI-H/dMMR患者有效率則顯著較低。KEYNOTE-177硏究表明，MSI-H/dMMR患者姑息一線應(yīng)用帕博利珠單抗,客觀緩解率為43.8%，而標(biāo)準(zhǔn)化療靶向組顯著較低，為33.1%[27]。MSI/MMR狀態(tài)對(duì)于遺傳性結(jié)直腸癌的診斷也具有較大的意義，尤其是林奇綜合征的診斷，MMR基因的胚系突變是確診的金標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)于臨床考慮遺傳性結(jié)直腸癌的患者，應(yīng)推薦常規(guī)進(jìn)行MSI/MMR狀態(tài)以幫助診斷；而對(duì)于其他結(jié)直腸癌患者，完善MSI/MMR狀態(tài)的檢測(cè)可為后續(xù)治療選擇提供參考依據(jù)。專家意見1：對(duì)于所有mCRC患者，均推薦在綜合治療前行常規(guī)分子標(biāo)志物檢測(cè)（RAS基因突變、BRAF基因突變、MSI狀態(tài)/MMR蛋白表達(dá)），根據(jù)結(jié)果制定個(gè)體化治療方案；推薦對(duì)于所有臨床懷疑林奇綜合征的患者，檢測(cè)MSI狀態(tài)/MMR蛋白表達(dá)進(jìn)行遺傳篩查。（二）其他分子標(biāo)志物檢測(cè)除上述常用分子標(biāo)志物外，目前，其他潛在的分子標(biāo)志物在結(jié)直腸癌中的發(fā)生率低，臨床意義及靶向治療的反應(yīng)性尚在評(píng)價(jià)中，如Her-2擴(kuò)增/過表達(dá)、PIK3CA突變、NTRK融合和腫瘤突變負(fù)荷（tumormutationalburden，TMB）。1.Her-2:Her-2是EGFR基因家族成員，其作為結(jié)直腸癌的原癌基因之一，可通過激活RAS-RAF-MEK和PI3K-AKT-mTOR通路，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤新生血管形成。結(jié)直腸癌中Her-2擴(kuò)增/過表達(dá)的總體發(fā)生率約為5%[28]，與KRAS、NRAS和BRAF突變存在相互排斥，且在原發(fā)腫瘤與轉(zhuǎn)移瘤之間高度一致。推薦對(duì)于經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療失敗后的mCRC患者可進(jìn)行Her-2擴(kuò)增/過表達(dá)的檢測(cè)。目前，結(jié)直腸癌Her-2的檢測(cè)方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)均來自臨床硏究方案，尚未建立經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)證的、作為伴隨診斷的檢測(cè)流程和判讀標(biāo)準(zhǔn)。NCCN指南和CSCO指南目前均推薦Her-2擴(kuò)增/過表達(dá)患者可接受抗Her-2靶向藥物的治療，兩個(gè)指南的差別在于CSCO指南推薦在姑息三線及三線治療以后使用，而NCCN指南則對(duì)姑息一線、不能耐受高強(qiáng)度治療的患者也有抗Her-2治療的推薦［17,18］。2?NTRK基因融合：NTRK基因融合在結(jié)直腸癌中比較罕見，發(fā)生率為0.35%。NTRK抑制劑僅對(duì)攜帶NTRK融合的患者有效，而對(duì)突變患者無(wú)效。IHC是-種有效，快速的初篩方法,IHC陽(yáng)性的腫瘤需使用FISH、PCR或NGS方法進(jìn)一步驗(yàn)證。由于NTRK基因融合發(fā)生率極低，目前僅推薦在標(biāo)準(zhǔn)治療失敗后、或者篩選臨床硏究的患者中進(jìn)行檢測(cè)。3?PIK3CA突變：在中國(guó)人群中PIK3CA突變率僅為3.5%，與RAS信號(hào)通路共同構(gòu)成EGFR下游兩條平行通路。與RAS和BRAF基因突變的排他性不同，PIK3CA突變可與RAS突變共同存在。根據(jù)部分已有的硏究結(jié)果，PIK3CA突變可能是對(duì)阿司匹林治療有效的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，但各硏究之間尚缺乏較好的一致性［29］。此外，由于PIK3CA突變與抗EGFR單抗療效的相關(guān)性目前尚不能完全確定，因此，目前尚不推薦對(duì)結(jié)直腸癌患者常規(guī)行PIK3CA突變檢測(cè)。

4?TMB:TMB是腫瘤組織DNA中基因組突變數(shù)的指數(shù)，它是測(cè)量腫瘤體細(xì)胞內(nèi)編碼蛋白的平均1Mb范圍內(nèi)的堿基突變數(shù)量，包括基因編碼錯(cuò)誤、堿基替換、基因插入或缺失等各種形式的突變。FDA于2020年6月批準(zhǔn)了免疫檢查點(diǎn)抑制劑用于治療高腫瘤突變負(fù)荷（TMB-H>10個(gè)突變/兆堿基）的無(wú)法切除或轉(zhuǎn)移性實(shí)體瘤的成年和兒童患者。目前在結(jié)直腸癌中尚不推薦常規(guī)行TMB檢測(cè)。專家意見2:對(duì)于經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療失敗的專家意見2:對(duì)于經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)治療失敗的mCRC者，可進(jìn)行Her-2擴(kuò)增/過表達(dá)和NTRK基因融合的檢測(cè)；PIK3CA突變檢測(cè)和TMB檢測(cè)僅限研究使用。（三）遺傳易感性基因檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌的遺傳易感性基因的檢測(cè)需要在胚系細(xì)胞中檢測(cè)才能明確。嚴(yán)格意義的胚系細(xì)胞是指精子和卵子?？紤]到樣本采集的便利性，臨床上常用外周血淋巴細(xì)胞或口腔黏膜細(xì)胞代替。在結(jié)直腸腫瘤中發(fā)現(xiàn)的突變?nèi)绻谕庵苎馨图?xì)胞或口腔黏膜細(xì)胞中得到證實(shí)，就可推定患者所有細(xì)胞都攜帶有該突變，可以認(rèn)為是胚系突變。與結(jié)直腸癌遺傳易感性相關(guān)的基因包括APC、MMR和STK-11等基因。其中，APC基因的突變和家族性腺瘤性息肉病（familialadenomatouspolyps,FAP）有關(guān)，其基因型和臨床表型存在相關(guān)性，即堿基突變的位置和息肉發(fā)生的嚴(yán)重程度有關(guān)。如懷疑FAP而APC基因無(wú)突變者，還需要進(jìn)一步檢測(cè)MUTYH基因突變。遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（林奇綜合癥）是一種常染色體顯性遺傳性疾病，其發(fā)病與MMR基因的胚系突變有關(guān)。MLH1、MSH2、MSH6和PMS2是最常見發(fā)生突變的4個(gè)MMR。大約70%的林奇綜合征患者是由MSH2和MLH1突變所致，其余30%多由MSH6和PMS2突變所致。專家意見3:對(duì)于臨床上懷疑診斷家族性息肉病、林奇綜合征和P-J綜合征等家族?性疾病者，推薦行相卻傳易感性基因的胚系突^（四）結(jié)直暢癌相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)IHC檢測(cè)是指用標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位、定量測(cè)定的一項(xiàng)免疫檢測(cè)方法。IHC檢測(cè)是腫瘤診療中的重要工具，對(duì)判定腫瘤來源、類型、惡性程度、耐藥和預(yù)后都提供了重要價(jià)值。本文主要描述了與結(jié)直腸癌鑒別診斷/輔助診斷有關(guān)的IHC標(biāo)志物，包含但不僅限于如下標(biāo)志物。專家意見4:對(duì)于結(jié)直腸癌患者，推薦對(duì)經(jīng)手術(shù)切除或活檢的原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶組織標(biāo)本行相關(guān)分子標(biāo)志物的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)，以幫助判定M來源和血三、檢測(cè)結(jié)果的解讀前已述及，目前主要的分子標(biāo)志物檢測(cè)方法包括IHC、FISH和基因測(cè)序等。在對(duì)結(jié)直腸癌基因檢測(cè)報(bào)告進(jìn)行解讀時(shí)，需對(duì)樣本的來源、檢測(cè)方法、檢測(cè)覆蓋的基因、變異類型、檢測(cè)結(jié)果等方面進(jìn)行詳細(xì)解讀。（一）標(biāo)本類型標(biāo)本類型包括腫瘤組織樣本和外周血樣本，其中外周血樣本又可細(xì)分為外周血有核細(xì)胞、外周血無(wú)細(xì)胞液體成分和CTC等。這些樣本既有體細(xì)胞來源的，也有胚系細(xì)胞來源。在使用腫瘤樣本進(jìn)行基因突變檢測(cè)時(shí)，由于原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶可能有異質(zhì)性的存在，因此在基因檢測(cè)報(bào)告中需要說明檢測(cè)樣本來源。（二）腫瘤細(xì)胞的比例不同的檢測(cè)方法對(duì)基因突變頻率的敏感性不同。需要在檢測(cè)報(bào)告中說明，本次受檢的腫瘤組織樣本中腫瘤細(xì)胞的比例是否符合檢測(cè)方法的要求。如果不符合，需要在檢測(cè)結(jié)果為陰性的報(bào)告中說明，以提示存在假陰性的可能。一般要求腫瘤細(xì)胞的比例至少要高于30%。CTC檢測(cè)應(yīng)在獲得外周血樣本2h內(nèi)進(jìn)行，同時(shí)，在報(bào)告中還應(yīng)注明富集的CTC數(shù)量。對(duì)于結(jié)直腸癌患者而言，不建議用外周血樣本的檢測(cè)陰性結(jié)果來指導(dǎo)抗EGFR單抗藥物的治療，以避免假陰性所造成的靶向藥物不獲益。檢測(cè)方法不同類型的突變和不同類型的樣本，需要選擇不同的檢測(cè)方法。在報(bào)告中說明檢測(cè)方法和該方法的局限性，對(duì)于正確理解檢測(cè)結(jié)果具有重要意義。第一代測(cè)序及熒光定量PCR，只能檢測(cè)特定區(qū)域或特定位點(diǎn)的基因突變，對(duì)于超過檢測(cè)范圍的突變位點(diǎn)、或罕見突變位點(diǎn)，則不能被檢出。FISH技術(shù)只能檢測(cè)基因的擴(kuò)增、缺失、異位倒位，而不能檢測(cè)基因的點(diǎn)突變。IHC技術(shù)只能用于蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。在傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上，NGS技術(shù)的發(fā)展和成熟，為實(shí)現(xiàn)單瘤種的所有基因變異以及泛瘤種的熱點(diǎn)基因變異進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)成為可能[30]。目前的NGS技術(shù)主要包括：NGS平臺(tái)目標(biāo)區(qū)域測(cè)序(panel檢測(cè))、全外顯子組測(cè)序(wholeexomesequencing，WES)和全基因組測(cè)序(wholegenomesequencing，WGS)。目前，用于結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物檢測(cè)的主要是NGS中的目標(biāo)區(qū)域測(cè)序。NGS的出現(xiàn)，為同時(shí)滿足上述所有的檢測(cè)需求提供了可能[31,32,33]。此外，NGS對(duì)于包括點(diǎn)突變、小片段插入缺失等具有更好的敏感性。對(duì)于有家族史的結(jié)直腸癌患者，需要同時(shí)檢測(cè)體細(xì)胞和胚系基因變異并比對(duì)，建議可選擇應(yīng)用NGS技術(shù)同時(shí)進(jìn)行腫瘤細(xì)胞及血液有核細(xì)胞的檢測(cè)。表表!■與結(jié)直腸瘙崟別診斷/備助診斷豈芫的免疫組織化學(xué)〔）標(biāo)IHC分子標(biāo)盂?]說明痊困碣（CEA）上皮棗源標(biāo)記「用=內(nèi)胚層來潮中瘤f少星成人上支細(xì)胞和良性^瘤亦可表這鋁胞角里自訊（CK20；胃腸上支移行上支％「屈細(xì)胞題飯迅,神經(jīng)內(nèi)分泌H瘤帛陰性，冃亍鑒別診新跖胞角重且了（CK7}上支來源標(biāo)記,通早在腺痊中表達(dá)「腺上支麗移行上卿胞表達(dá)r非上支來源釦郵D2-40淋巴管囚支田胞版為特異的樁志物「呈M瘤淋巴管形翊1漸巴管圜Q的重娶標(biāo)記”f盲訥序列特異3合蚩白辺在天腦■.港■（七直組或L骨題免疫至統(tǒng)中表達(dá)較高r在具他組奴口基林表達(dá)”S2(SAIB2)率絨毛里白（Villin}絨毛蚩白r劇狀嫁的上皮細(xì)胞妻達(dá)r仕邑腸道惡性中陽(yáng)性表達(dá)率高,可用〒鑒^目前，NGS檢測(cè)涵蓋的點(diǎn)突變從單瘤種的幾十個(gè)基因到泛瘤種的上千個(gè)基因。除此以外，還常常整合了不同數(shù)量的PCR檢測(cè)用于檢測(cè)基因的擴(kuò)增、融合和微衛(wèi)星穩(wěn)定。對(duì)于NGS檢測(cè)結(jié)果中的突變豐度值，需綜合評(píng)估NGS實(shí)驗(yàn)平臺(tái)性能、測(cè)序深度和腫瘤細(xì)胞比例等因素綜合考慮。（四）基因變異類型1?點(diǎn)突變：在RAS和BRAF基因突變檢測(cè)時(shí)，至少要包含KRAS和NRAS基因的第2、3、4號(hào)外顯子及BRAF基因的V600E位點(diǎn)。2?插入突變：遺傳易感基因BRCA1和BRCA2基因編碼區(qū)（包括BRCA1外顯子2,3,5-24;BRCA2外顯子2-27）及外顯子-內(nèi)含子鏈接區(qū)、UTR區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)的插入突變。3?缺失突變：BRCA1部分內(nèi)含子20和外顯子20跳躍造成的異常剪接。4?基因融合：結(jié)直腸癌中新興的生物標(biāo)志物NTRK基因融合。5?基因擴(kuò)增:Her-2基因擴(kuò)增。6?基因缺失：遺傳易感基因TP53、RB1等基因缺失。（五）檢測(cè)結(jié)果1?IHC告的模板及■點(diǎn)參當(dāng)以IHC作為檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)注明樣本來源、抗體的克隆號(hào)以及蛋白表達(dá)的百分比。2.PCR報(bào)告的模板及重點(diǎn)參PCR報(bào)告應(yīng)包括樣本來源、腫瘤細(xì)胞比例、使用方法、檢測(cè)位點(diǎn)及范圍突變豐度和基因變異的解讀。(1)報(bào)告基本信息：檢測(cè)名稱及編號(hào)：如"結(jié)直腸癌基因變異檢測(cè)報(bào)告CRC201900001";患者基本信息：姓名、年齡、性別和住院號(hào)等；樣本信息：病理號(hào)、取材部位、樣本類型［經(jīng)甲醛固定石蠟包埋處理的樣本(formalin-fixedandparrffin-embedded，F(xiàn)FPE)、新鮮組織、血液等］、送檢醫(yī)院科室及醫(yī)師、送檢日期和報(bào)告日期等；病理信息：病理診斷、腫瘤細(xì)胞比例、特殊說明(出血、壞死、脫鈣處理等)；臨床病史：可提供疾病史、治療史、家族史等;檢測(cè)項(xiàng)目：所檢測(cè)的基因目錄、覆蓋范圍和變異類型、檢測(cè)平臺(tái)名稱、分析軟件版本號(hào)等(建議選擇國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)認(rèn)可的產(chǎn)品。(2)標(biāo)本質(zhì)控信息：標(biāo)本病理評(píng)估：FFPE樣本經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，評(píng)估樣本所含腫瘤細(xì)胞比例，建議組織標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞比例達(dá)到30%以上，腫瘤細(xì)