基于snp位點的茶樹品種資源分子身份證構(gòu)建

基于snp位點的茶樹品種資源分子身份證構(gòu)建

0總結(jié)茶樹是多年生異花授粉植物，具有高度的異質(zhì)性和混合性。1材料和方法1.1茶樹種質(zhì)資源供試茶樹品種資源來源于武夷學院茶樹種質(zhì)資源圃（福建省武夷山市）和福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所茶樹種質(zhì)資源圃（福建省福安市），其中，中國茶樹品種資源有101份，來自華南、西南、江南、江北四大茶產(chǎn)區(qū)的10個茶葉主產(chǎn)區(qū)省份；國外茶樹品種2份，包括日本的玉綠和格魯吉亞的格魯吉亞1號。茶樹品種資源詳細信息見電子附表1。1.2dna的提取和鑒定采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN,DP320，北京）提取基因組DNA，利用超微量紫外分光光度計（Implen,S60716，德國）測定DNA濃度和純度。提取的基因組DNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?.3茶樹表達序列標簽的開發(fā)中國烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心課題組前期從國家生物信息中心（nationalcenterofbiotechnologyinformation,NCBI）的數(shù)據(jù)庫（/）中下載了茶樹的表達序列標簽（expresssequencetags,EST），獲得大量可用于數(shù)據(jù)挖掘的高質(zhì)量EST。經(jīng)過軟件CAP3程序?qū)⑿蛄醒b配，再利用QualitySNP在含有6條以上同源序列重疊群中開發(fā)候選SNP位點，得到了1786個候選EST-SNP位點。為確保獲得高質(zhì)量的SNP用于后期驗證，之后進入人工選擇，要求篩選出的SNP位點前后有60bp堿基完全保守，最終篩選出用于茶樹種質(zhì)資源的96個SNP標記位點1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用FluidigmSNPGenotypingAnalysis軟件（/software）進行數(shù)據(jù)導出和分析，并確定每個SNP位點處的樣品基因型是純合子或雜合子。使用GenAlEx6.503軟件分析等位基因頻率（allelefrequency）、信息指數(shù)（informationindex,I）、觀察雜合度（observedheterozygosity,Ho）、預期雜合度（expectedheterozygosity,He）、固定指數(shù)（fixationindex,F）和次等位基因頻率（minorallelefrequency,MAF）。將茶樹品種資源基本信息與其DNA指紋圖譜信息結(jié)合，利用在線條碼生成器（）和二維碼在線生成軟件（/）以數(shù)字條碼的形式構(gòu)建茶樹品種資源分子身份證。2結(jié)果2.1剩余snp位點的多態(tài)性采用的96個SNP標記位點較均勻地分布于茶樹全基因組15條染色體上（電子附表2）。對103份茶樹品種資源進行分析，剔除10個不具多態(tài)性的引物后，剩余86個SNP位點多態(tài)性的相關(guān)信息列于電子附表3。根據(jù)統(tǒng)計，這些SNP標記多態(tài)性信息指數(shù)（I）為0.071—0.693，平均值為0.517。觀測雜合度（Ho）范圍為0.027—0.982，平均值為0.370。期望雜合度（He）的范圍在0.026—0.500，平均值為0.346。固定指數(shù)（F）為-0.964—0.462，平均值為-0.036。次等位基因頻率（MAF）范圍在0.013—0.500，平均值為0.269。2.2茶樹品種資源的snp位點分析信息指數(shù)常用來評價群落的遺傳多樣性，如果每一個體都屬于不同的種，多樣性指數(shù)就最大；如果每一個體都屬于同一種，則其多樣性指數(shù)就最小，即多樣性指數(shù)越高，其區(qū)分品種能力卻強。因此，基于103份茶樹品種資源材料，對SNP數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，從86個SNP位點中優(yōu)化篩選了24個多態(tài)性較高的SNP位點（電子附表4，圖1），可將103份茶樹品種資源完全區(qū)分開。DNA指紋圖譜（圖2）顯示每個SNP位點處的樣品是雜合子（XY）或純合子（XX,YY）。對篩選獲得的最佳SNP數(shù)據(jù)進行數(shù)字編碼，作為構(gòu)建分子身份證基本信息。在24個SNP標記，共有24種基因型，3種等位基因（XY、XX和YY），因此，每個位點分別用1—3代表等位基因多態(tài)性。以福鼎大白茶為例，在CS3處的基因型為TC，對應XY，編碼為1，以此類推，將基因型全部轉(zhuǎn)換成24數(shù)字編碼為131132311121332112313231。2.4有關(guān)tea胚胎血漿特征的信息編碼茶樹的基本信息由4位數(shù)字組成，其中，茶樹品種資源類型分類參考陳亮等2.5c.sinens分子標記基本商品信息和DNA指紋圖譜共同組成由28位數(shù)字編碼的茶樹品種資源分子身份證（表1）。以國家級品種福鼎大白茶舉例，其品種資源基本信息為：屬茶組植物中的茶樹（C.sinensis），原產(chǎn)于福建，品種資源類型為優(yōu)良品種，轉(zhuǎn)換成數(shù)字碼為1353；其24個SNP分子標記的基因型分別為TC、TT、AT、CT、GG、GG、CC、TC、TG、TC、TT、AG、GG、TT、CC、AG、CT、TT、CC、AT、GG、GG、CC、TC，轉(zhuǎn)換成24位數(shù)字碼為131132311121332112313231。則福鼎大白茶的分子身份證為1353131132311121332112313231（圖3-A），將其轉(zhuǎn)化為條形碼和二維碼如圖3-B所示。3討論3.1茶樹品種親子代的snp標記本研究103份茶樹品種資源樣品來源于中國的四大茶產(chǎn)區(qū)，以及日本和格魯吉亞，來源范圍廣，茶樹品種資源遺傳多樣性豐富，其中也有遺傳背景相近的茶樹品種親子代，如福鼎大白茶和云南大葉種的自然雜交后代福云6號、福云7號和福云595，及以四川中葉種為母本、云南大葉種為父本的蜀永2號、蜀永3號和蜀永703。本研究中所選用的96個SNP標記位點中，多態(tài)性標記為86個，占比為89.6%。SNP標記一般只有2種堿基組成，因此，被認為具有二態(tài)性；由于具有等位基因性的特點，其等位基因在任何種群中都可被估算出來。除此之外，SNP標記在不同條件下具有較高的重復性和準確性3.2選擇優(yōu)質(zhì)茶葉提取物的確認篩選較少的引物，可以縮短茶樹品種資源鑒定的時間，降低應用成本。最佳引物的選擇是構(gòu)建指紋圖譜和分子身份證的重要步驟。PAN3.3分子身份證的應用有利于品種鑒定與保護作物品種資源的分子身份證與DNA指紋圖譜的功能相同，都是為了區(qū)分不同生物個體。相對于指紋圖譜，分子身份證是將作物品種資源的基本信息用特定的數(shù)字編碼為數(shù)字串，并且輔以條形碼、二維碼的形式展現(xiàn)，更加簡明直觀地區(qū)分品種資源之間的差異。分子身份證因其自身所具有特性，可利用機器進行掃描，達到方便快捷地識別大量品種資源，提高品種資源鑒定和評價的效率。另外，分子身份證的唯一性，也可有效甄別市場上同名異物、同物異名現(xiàn)象，有利于品種識別與保護。許多植物已利用分子標記技術(shù)構(gòu)建分子身份證，如水稻4國外品種和優(yōu)良品種的選擇篩選出24個最佳SNP位點組合，可精準區(qū)分全部