基于snp位點(diǎn)的茶樹(shù)品種資源分子身份證構(gòu)建

基于snp位點(diǎn)的茶樹(shù)品種資源分子身份證構(gòu)建

0總結(jié)茶樹(shù)是多年生異花授粉植物，具有高度的異質(zhì)性和混合性。1材料和方法1.1茶樹(shù)種質(zhì)資源供試茶樹(shù)品種資源來(lái)源于武夷學(xué)院茶樹(shù)種質(zhì)資源圃（福建省武夷山市）和福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶樹(shù)種質(zhì)資源圃（福建省福安市），其中，中國(guó)茶樹(shù)品種資源有101份，來(lái)自華南、西南、江南、江北四大茶產(chǎn)區(qū)的10個(gè)茶葉主產(chǎn)區(qū)省份；國(guó)外茶樹(shù)品種2份，包括日本的玉綠和格魯吉亞的格魯吉亞1號(hào)。茶樹(shù)品種資源詳細(xì)信息見(jiàn)電子附表1。1.2dna的提取和鑒定采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN,DP320，北京）提取基因組DNA，利用超微量紫外分光光度計(jì)（Implen,S60716，德國(guó)）測(cè)定DNA濃度和純度。提取的基因組DNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?.3茶樹(shù)表達(dá)序列標(biāo)簽的開(kāi)發(fā)中國(guó)烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心課題組前期從國(guó)家生物信息中心（nationalcenterofbiotechnologyinformation,NCBI）的數(shù)據(jù)庫(kù)（/）中下載了茶樹(shù)的表達(dá)序列標(biāo)簽（expresssequencetags,EST），獲得大量可用于數(shù)據(jù)挖掘的高質(zhì)量EST。經(jīng)過(guò)軟件CAP3程序?qū)⑿蛄醒b配，再利用QualitySNP在含有6條以上同源序列重疊群中開(kāi)發(fā)候選SNP位點(diǎn)，得到了1786個(gè)候選EST-SNP位點(diǎn)。為確保獲得高質(zhì)量的SNP用于后期驗(yàn)證，之后進(jìn)入人工選擇，要求篩選出的SNP位點(diǎn)前后有60bp堿基完全保守，最終篩選出用于茶樹(shù)種質(zhì)資源的96個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析利用FluidigmSNPGenotypingAnalysis軟件（/software）進(jìn)行數(shù)據(jù)導(dǎo)出和分析，并確定每個(gè)SNP位點(diǎn)處的樣品基因型是純合子或雜合子。使用GenAlEx6.503軟件分析等位基因頻率（allelefrequency）、信息指數(shù)（informationindex,I）、觀察雜合度（observedheterozygosity,Ho）、預(yù)期雜合度（expectedheterozygosity,He）、固定指數(shù)（fixationindex,F）和次等位基因頻率（minorallelefrequency,MAF）。將茶樹(shù)品種資源基本信息與其DNA指紋圖譜信息結(jié)合，利用在線條碼生成器（）和二維碼在線生成軟件（/）以數(shù)字條碼的形式構(gòu)建茶樹(shù)品種資源分子身份證。2結(jié)果2.1剩余snp位點(diǎn)的多態(tài)性采用的96個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)較均勻地分布于茶樹(shù)全基因組15條染色體上（電子附表2）。對(duì)103份茶樹(shù)品種資源進(jìn)行分析，剔除10個(gè)不具多態(tài)性的引物后，剩余86個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的相關(guān)信息列于電子附表3。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，這些SNP標(biāo)記多態(tài)性信息指數(shù)（I）為0.071—0.693，平均值為0.517。觀測(cè)雜合度（Ho）范圍為0.027—0.982，平均值為0.370。期望雜合度（He）的范圍在0.026—0.500，平均值為0.346。固定指數(shù)（F）為-0.964—0.462，平均值為-0.036。次等位基因頻率（MAF）范圍在0.013—0.500，平均值為0.269。2.2茶樹(shù)品種資源的snp位點(diǎn)分析信息指數(shù)常用來(lái)評(píng)價(jià)群落的遺傳多樣性，如果每一個(gè)體都屬于不同的種，多樣性指數(shù)就最大；如果每一個(gè)體都屬于同一種，則其多樣性指數(shù)就最小，即多樣性指數(shù)越高，其區(qū)分品種能力卻強(qiáng)。因此，基于103份茶樹(shù)品種資源材料，對(duì)SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從86個(gè)SNP位點(diǎn)中優(yōu)化篩選了24個(gè)多態(tài)性較高的SNP位點(diǎn)（電子附表4，圖1），可將103份茶樹(shù)品種資源完全區(qū)分開(kāi)。DNA指紋圖譜（圖2）顯示每個(gè)SNP位點(diǎn)處的樣品是雜合子（XY）或純合子（XX,YY）。對(duì)篩選獲得的最佳SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字編碼，作為構(gòu)建分子身份證基本信息。在24個(gè)SNP標(biāo)記，共有24種基因型，3種等位基因（XY、XX和YY），因此，每個(gè)位點(diǎn)分別用1—3代表等位基因多態(tài)性。以福鼎大白茶為例，在CS3處的基因型為TC，對(duì)應(yīng)XY，編碼為1，以此類推，將基因型全部轉(zhuǎn)換成24數(shù)字編碼為131132311121332112313231。2.4有關(guān)tea胚胎血漿特征的信息編碼茶樹(shù)的基本信息由4位數(shù)字組成，其中，茶樹(shù)品種資源類型分類參考陳亮等2.5c.sinens分子標(biāo)記基本商品信息和DNA指紋圖譜共同組成由28位數(shù)字編碼的茶樹(shù)品種資源分子身份證（表1）。以國(guó)家級(jí)品種福鼎大白茶舉例，其品種資源基本信息為：屬茶組植物中的茶樹(shù)（C.sinensis），原產(chǎn)于福建，品種資源類型為優(yōu)良品種，轉(zhuǎn)換成數(shù)字碼為1353；其24個(gè)SNP分子標(biāo)記的基因型分別為TC、TT、AT、CT、GG、GG、CC、TC、TG、TC、TT、AG、GG、TT、CC、AG、CT、TT、CC、AT、GG、GG、CC、TC，轉(zhuǎn)換成24位數(shù)字碼為131132311121332112313231。則福鼎大白茶的分子身份證為1353131132311121332112313231（圖3-A），將其轉(zhuǎn)化為條形碼和二維碼如圖3-B所示。3討論3.1茶樹(shù)品種親子代的snp標(biāo)記本研究103份茶樹(shù)品種資源樣品來(lái)源于中國(guó)的四大茶產(chǎn)區(qū)，以及日本和格魯吉亞，來(lái)源范圍廣，茶樹(shù)品種資源遺傳多樣性豐富，其中也有遺傳背景相近的茶樹(shù)品種親子代，如福鼎大白茶和云南大葉種的自然雜交后代福云6號(hào)、福云7號(hào)和福云595，及以四川中葉種為母本、云南大葉種為父本的蜀永2號(hào)、蜀永3號(hào)和蜀永703。本研究中所選用的96個(gè)SNP標(biāo)記位點(diǎn)中，多態(tài)性標(biāo)記為86個(gè)，占比為89.6%。SNP標(biāo)記一般只有2種堿基組成，因此，被認(rèn)為具有二態(tài)性；由于具有等位基因性的特點(diǎn)，其等位基因在任何種群中都可被估算出來(lái)。除此之外，SNP標(biāo)記在不同條件下具有較高的重復(fù)性和準(zhǔn)確性3.2選擇優(yōu)質(zhì)茶葉提取物的確認(rèn)篩選較少的引物，可以縮短茶樹(shù)品種資源鑒定的時(shí)間，降低應(yīng)用成本。最佳引物的選擇是構(gòu)建指紋圖譜和分子身份證的重要步驟。PAN3.3分子身份證的應(yīng)用有利于品種鑒定與保護(hù)作物品種資源的分子身份證與DNA指紋圖譜的功能相同，都是為了區(qū)分不同生物個(gè)體。相對(duì)于指紋圖譜，分子身份證是將作物品種資源的基本信息用特定的數(shù)字編碼為數(shù)字串，并且輔以條形碼、二維碼的形式展現(xiàn)，更加簡(jiǎn)明直觀地區(qū)分品種資源之間的差異。分子身份證因其自身所具有特性，可利用機(jī)器進(jìn)行掃描，達(dá)到方便快捷地識(shí)別大量品種資源，提高品種資源鑒定和評(píng)價(jià)的效率。另外，分子身份證的唯一性，也可有效甄別市場(chǎng)上同名異物、同物異名現(xiàn)象，有利于品種識(shí)別與保護(hù)。許多植物已利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建分子身份證，如水稻4國(guó)外品種和優(yōu)良品種的選擇篩選出24個(gè)最佳SNP位點(diǎn)組合，可精準(zhǔn)區(qū)分全部