基于issr標(biāo)記構(gòu)建蘇杭菜和利川菜的分子身份證

基于issr標(biāo)記構(gòu)建蘇杭菜和利川菜的分子身份證

流行花是大量水生植物和重要水生作物，屬于水生百合科或水煮草科。莼菜很早就被奉為珍貴食品,其主要食用部分是富含膠質(zhì)而未展開(kāi)的幼嫩卷葉,含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)、維生素和微量元素,并具有很高的藥用價(jià)值近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)莼菜的研究主要涉及莼菜栽培、食用和藥用價(jià)值1材料和方法1.1幼嫩葉片的采集莼菜植株材料采自6個(gè)不同地區(qū),分別為華中地區(qū)的利川忠路(LCZ)、利川福寶山(LCF)和利川白河嶺(LCY),華東地區(qū)的杭州西湖大清谷(SDS)、杭州周浦(HZC)和蘇州東山(HZD)。在莼菜開(kāi)花期間,共采集上述6個(gè)不同地方的46株莼菜的新鮮幼嫩葉片,每株5~10g(表1)。對(duì)于自然居群采集的樣本數(shù)目較多,而人工種植居群僅少量采樣(如利川白河嶺等),因此,取樣數(shù)目差別較大(2~15)。由于莼菜主要營(yíng)克隆(無(wú)性)繁殖,而且其地下莖在水中為叢生狀、多分枝,因而采樣時(shí)盡量間隔一定距離取樣,以避免相鄰的取樣其實(shí)為同一株莼菜。將每份幼嫩葉樣本置于裝有硅膠的密封袋中迅速干燥,備用。采用CTAB法提取上述不同品種的莼菜幼葉的基因組DNA1.2pcr擴(kuò)增和品種鑒定引物的篩選從購(gòu)自上海生工生物工程公司的60個(gè)ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性較好的6條引物用于PCR擴(kuò)增和品種的鑒定。這6條引物分別是P810、P817、P825、P834、P845和P848,其序列見(jiàn)表2。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-1001.3同一遷移方向上有條帶共條帶ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按條帶的有無(wú)分別進(jìn)行0、1數(shù)據(jù)處理,在相同遷移位置上有條帶的(包括弱帶)記為“1”,無(wú)條帶的記為“0”。采用POPGNENversion1.32版軟件1.4不同品種ssr指紋圖譜的構(gòu)建以其中能夠穩(wěn)定產(chǎn)生華東蘇杭和華中利川莼菜特異帶型的3條ISSR引物(P825、P845、P817)作為鑒別不同品種的核心引物,形成莼菜品種資源的ISSR指紋圖譜,構(gòu)建鑒別蘇杭莼菜品種和利川莼菜品種的特異的分子身份證模式。2結(jié)果與分析2.1中華文明區(qū)域間菜issr數(shù)據(jù)的分子變異共計(jì)46份莼菜樣本來(lái)自6個(gè)居群,分別屬于華中和華東地區(qū)2個(gè)大的區(qū)域。首先,利用不同居群莼菜ISSR數(shù)據(jù)進(jìn)行分子變異(AMOVA)分析,結(jié)果表明居群間遺傳分子變異有顯著性差異(P<0.001)(表3)。在總的遺傳變異中,85.6%的分子變異來(lái)源于居群間,而僅有14.4%的變異來(lái)源于居群內(nèi)部。其次,對(duì)兩大區(qū)域(華東與華中地區(qū))間的莼菜ISSR數(shù)據(jù)進(jìn)行分子變異分析表明,區(qū)域間分子變異的比率為81.2%,也達(dá)到顯著性差異(P<0.001),而來(lái)源于區(qū)域內(nèi)部的分子變異僅為18.8%。采用巢式分析法(nestedanalysis)綜合分析區(qū)域間、居群間以及居群內(nèi)部的分子變異顯示:2個(gè)大的區(qū)域間分子變異的比率為74.4%,區(qū)域居群間變異的比率為14.9%,區(qū)域居群內(nèi)變異的比率為10.7%,分子變異都達(dá)到顯著性差異(P<0.001)。分析結(jié)果表明這些莼菜的分子變異主要來(lái)源于區(qū)域的不同,即不同區(qū)域自然地理特征的差異是造成其分子變異的主要因素,其次是區(qū)域內(nèi)居群間的分離產(chǎn)生了一定的分子變異,而居群內(nèi)部不同莼菜個(gè)體間的分子變異比率最小。2.2居群間遺傳距離和距離分布利用軟件NTSYSpc2.02對(duì)莼菜不同居群間遺傳距離和遺傳相似度比較分析,結(jié)果顯示不同莼菜居群間的遺傳一致度的范圍為0.69~0.99(圖1A),遺傳距離變化范圍為0.01~0.37(圖1B)。居群LCF與居群LCY、LCZ之間的遺傳距離表現(xiàn)最小,為0.01;同時(shí),居群LCF與LCY、LCZ之間的遺傳一致性最大(0.99);而居群LCY與居群HZD之間遺傳距離表現(xiàn)最大,為0.37,這2個(gè)居群間遺傳一致性則最小(0.69)。值得注意的是居群之間的遺傳差異化程度表現(xiàn)出與地理距離大小變化相關(guān)。在同一大區(qū)域內(nèi),如華中地區(qū)3個(gè)居群之間的地理距離為22~30km(圖1C-Ⅰ),華東地區(qū)3個(gè)居群之間的地理距離為23~113km(圖1C-Ⅱ),各自區(qū)域內(nèi)居群間的距離相對(duì)較近。比較發(fā)現(xiàn)區(qū)域內(nèi)部居群之間的遺傳距離變化范圍為0.01~0.11,遺傳距離很近;其遺傳一致度變化范圍為0.90~0.99,表現(xiàn)出很高的相似度。而在兩大區(qū)域之間,不同居群相對(duì)的地理距離為1080~1142km(圖1C-Ⅲ),兩兩居群之間相距較遠(yuǎn)。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)不同區(qū)域居群之間的遺傳距離都在0.20以上,其變化范圍為0.20~0.37,遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn);其遺傳一致度都低于0.90,變化范圍為0.69~0.82,表現(xiàn)出相對(duì)較低的相似度。所以從圖1分析可以看出,居群間的遺傳距離大小總體上與地理距離大小有正相關(guān)趨勢(shì),地理距離的加大促進(jìn)了不同莼菜居群間遺傳距離的加大,不過(guò)沒(méi)有表現(xiàn)出固定的比例關(guān)系。而居群之間的一致度系數(shù)則與它們之間的地理距離大小有負(fù)相關(guān)趨勢(shì),地理距離的加大導(dǎo)致了居群間遺傳一致度的降低,增加了遺傳的差異化。2.3菜的聚類(lèi)分析利用無(wú)權(quán)重配對(duì)算術(shù)平均數(shù)法(UPGMA)對(duì)6個(gè)莼菜居群進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果顯示在遺傳距離為0.28處6個(gè)居群明顯形成2個(gè)分支,華東地區(qū)的3個(gè)莼菜居群(SDS、HZD、HZC)成為一支,而華中地區(qū)的3個(gè)莼菜居群(LCF、LCZ、LCY)成為另一支(圖2A)。同樣,根據(jù)Nei’s遺傳距離系數(shù),對(duì)6個(gè)居群中的所有46個(gè)莼菜個(gè)體進(jìn)行了UPGMA聚類(lèi)分析,結(jié)果顯示在遺傳距離為0.75處也形成2個(gè)分支,來(lái)自華東地區(qū)3個(gè)居群的23個(gè)個(gè)體聚成一支,來(lái)自華中地區(qū)3個(gè)居群的23個(gè)個(gè)體聚成另一支(圖2B)。因此,從居群水平和個(gè)體水平上華中地區(qū)莼菜品種和華東地區(qū)莼菜品種都表現(xiàn)出與地理區(qū)域隔離相一致的差異,說(shuō)明長(zhǎng)期長(zhǎng)距離的地理隔離造成了華中莼菜和華東莼菜各自形成了獨(dú)立的遺傳進(jìn)化種群,分別在相異的自然生境條件下積累了不同的分子變異。仔細(xì)比較華中和華東內(nèi)部莼菜居群,可以看出華中內(nèi)部莼菜居群采樣點(diǎn)之間的距離較近(22~30km),居群之間的遺傳差異相對(duì)較小,居群內(nèi)個(gè)體在內(nèi)部小分支上分散分布;華東內(nèi)部莼菜居群采樣點(diǎn)之間的距離較遠(yuǎn)(23~113km),居群之間的遺傳差異相對(duì)較大,居群內(nèi)個(gè)體在內(nèi)部小分支上分布呈現(xiàn)SDS居群與HZD居群相互分離,在遺傳距離約為0.88處形成2個(gè)亞分支,而居群HZC在上述2個(gè)亞分支上都有分布。不同莼菜品種在聚類(lèi)分析上的這些差異進(jìn)一步體現(xiàn)了地理隔離對(duì)莼菜分子變異的影響。2.4利川菜3條譜帶在6條ISSR引物中,引物P817、P825、P845擴(kuò)增的ISSR指紋圖譜呈現(xiàn)出特異性DNA譜帶,能分別鑒別蘇杭莼菜品種和利川莼菜品種(圖3)。用引物P817擴(kuò)增能夠在所有莼菜群體中產(chǎn)生9條譜帶,其中4條譜帶為蘇杭莼菜所特有(P817-1000、400、250、200),3條譜帶為利川莼菜所特有(P817-800、550、490),只有2條譜帶為所有莼菜共有(P817-1300、900)。用引物P825擴(kuò)增能夠產(chǎn)生6條譜帶,其中4條譜帶為所有莼菜共有(P825-800、620、470、390),利川莼菜多了2條特異譜帶,分別是P817-930和P817-300。用引物P845擴(kuò)增能夠產(chǎn)生9條譜帶,也是其中4條譜帶為蘇杭莼菜多特有(P845-1050、870、400、200),3條譜帶為利川莼菜所特有(P848-780、500、320),2條譜帶為所有莼菜共有(P845-1300、250)。利用46份供試莼菜產(chǎn)生的這些擴(kuò)增譜帶構(gòu)建的華中利川莼菜品種和華東蘇杭莼菜品種的分子身份證模式如圖4,這3條核心引物均可作為鑒定蘇杭莼菜品種和利川莼菜品種特異的分子標(biāo)記,使得每個(gè)品種都能產(chǎn)生唯一的指紋圖譜。3分子水平上的差異莼菜種質(zhì)資源可分為不同的品種,例如袁居正結(jié)合地理距離大小的差異比較分析居群間的遺傳距離和遺傳相似性系數(shù),結(jié)果顯示遺傳距離大小總體上與地理距離大小有正相關(guān)趨勢(shì),而一致度系數(shù)則與地理距離大小有負(fù)相關(guān)趨勢(shì),或者說(shuō)是地理距離的加大促進(jìn)了不同莼菜居群間遺傳距離的加大,增加了遺傳的差異,降低了遺傳一致度系數(shù)。采用基于ISSR分子數(shù)據(jù)的UPGMA聚類(lèi)分析顯示,無(wú)論在居群水平還是個(gè)體水平都形成華東蘇杭莼菜和華中利川莼菜兩大分支,說(shuō)明它們?cè)诜肿铀缴弦呀?jīng)發(fā)生了顯著的差異。華東蘇杭莼菜和華中利川莼菜發(fā)生分子水平上的分歧主要是由內(nèi)因和外因共同作用的結(jié)果。莼菜的繁殖主要是利用根狀莖進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖,但是也開(kāi)花并通過(guò)蟲(chóng)媒異交繁殖。遺傳物質(zhì)的自然突變是個(gè)體間分子變異產(chǎn)生的內(nèi)部原因,而異交引起的遺傳物質(zhì)交流既是個(gè)體間產(chǎn)生變異的動(dòng)力,也導(dǎo)致了居群內(nèi)部個(gè)體間的遺傳平衡,使得分子變異在異交群體內(nèi)擴(kuò)散、保留,形成獨(dú)特的居群結(jié)構(gòu)特征,從而產(chǎn)生了居群間的差異。莼菜的生長(zhǎng)生存要適應(yīng)于所處的地理環(huán)境,在其進(jìn)化歷程中不斷受到地理環(huán)境因子(如溫度、濕度、降水、陽(yáng)光等)的影響。不同環(huán)境條件對(duì)莼菜進(jìn)化的選擇作用不盡相同,即對(duì)莼菜遺傳物質(zhì)的自然變異頻率、蟲(chóng)媒異交行為等產(chǎn)生不同影響,因而導(dǎo)致產(chǎn)生了不同區(qū)域的莼菜在分子變異上的差異。而這些變異在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中不斷積累,形成了現(xiàn)在不同區(qū)