熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析課件

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與常見問題解決技術(shù)支持

黃志熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析與常見問題解決技術(shù)支持內(nèi)容LifeTechnologies公司定量PCR儀產(chǎn)品概覽熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見問題的解決內(nèi)容LifeTechnologies公司定量PCR儀產(chǎn)AB熒光定量PCR儀的發(fā)展歷史1995 世界上第一臺(tái)定量PCR儀--7700型誕生1997 推出面向醫(yī)療系統(tǒng)用戶的5700型定量PCR儀2000 推出7900型384孔定量PCR儀2001

推出7900型96孔定量PCR儀2001 推出7000型96孔定量PCR儀2004 獲得定量PCR儀專利－確立AB在業(yè)界內(nèi)的領(lǐng)先地位2004 第5代定量PCR儀7300\7500型誕生第6代定量PCR儀StepOne和StepOnePlus問世第7代定量PCR儀ViiA7發(fā)布

最新熒光定量PCR儀QuantStudio12KFlex發(fā)布AB熒光定量PCR儀的發(fā)展歷史1995 世界上第一臺(tái)定量PCAB熒光定量PCR儀家族第一、二代77005700第三、四代70007900第五代7300

7500第六代stepone/plus第七代ViiA7最新型QuantStudioAB熒光定量PCR儀家族第一、二代第三、四代第五代第六代第七熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析流程查驗(yàn)擴(kuò)增曲線檢查/調(diào)整基線檢查/調(diào)整閾值檢查NTC檢查陽(yáng)性對(duì)照檢查陰性對(duì)照分析樣品數(shù)據(jù)熒光PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析流程查驗(yàn)擴(kuò)增曲線檢查/調(diào)整基線檢基線與閾值線的設(shè)置一般情況下選擇軟件默認(rèn)的“自動(dòng)設(shè)置”；特殊情況下或必要時(shí)，可以手動(dòng)設(shè)置；手動(dòng)設(shè)置的原則請(qǐng)查詢“DataAnalysisontheABIPRISM?7700SequenceDetectionSystem:SettingBaselinesandThresholds:Guide:RevA”，文件號(hào)：4370923?；€與閾值線的設(shè)置一般情況下選擇軟件默認(rèn)的“自動(dòng)設(shè)置”；基線的設(shè)定系統(tǒng)背景信號(hào)，在扣除背景過程中影響擴(kuò)增信號(hào)的數(shù)值，最終影響Ct值。默認(rèn)自動(dòng)分析，比如設(shè)定在“3-15”個(gè)循環(huán)。手動(dòng)設(shè)置時(shí)要避開前期的熒光波動(dòng)與后期的擴(kuò)增信號(hào)。必要時(shí)可以獨(dú)立設(shè)定制定樣品的基線取值范圍（V2.0）?；€的設(shè)定系統(tǒng)背景信號(hào)，在扣除背景過程中影響擴(kuò)增信號(hào)的數(shù)值，閾值線的設(shè)定默認(rèn)設(shè)定為同類擴(kuò)增基線信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，反映擴(kuò)增信號(hào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的意義。不同擴(kuò)增子應(yīng)當(dāng)獨(dú)立設(shè)定閾值線。手動(dòng)設(shè)置在“指數(shù)擴(kuò)增期”，避開前期的背景熒光波動(dòng)與后期的非指數(shù)擴(kuò)增及陰性對(duì)照最高點(diǎn)。對(duì)于絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)，閾值線設(shè)定在使得標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)值（R2）接近1，斜率接近-3.32的地方。對(duì)于無(wú)標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)，閾值線設(shè)定在使得重復(fù)樣品Ct值差異最小的位置。閾值線設(shè)定在保障靈敏度均為最佳的位置閾值線的設(shè)定默認(rèn)設(shè)定為同類擴(kuò)增基線信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，反映擴(kuò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的考評(píng)指標(biāo)定性實(shí)驗(yàn)：是否為顯著的“S型”擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線的“高度”----表示體現(xiàn)擴(kuò)增性能的“強(qiáng)度”陽(yáng)性對(duì)照的Ct值是否在“預(yù)期”的位置：過早——污染或加樣錯(cuò)誤過晚——存在抑制劑或擴(kuò)增體系條件不佳陰性對(duì)照是否報(bào)告Ct值污染、探針特異性差、閾值線設(shè)定過低絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率或擴(kuò)增效率標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)值：R2檢測(cè)樣品是否偏離標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)樣品Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差實(shí)驗(yàn)結(jié)果的考評(píng)指標(biāo)定性實(shí)驗(yàn)：絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)：絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)效果的評(píng)估絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)效果的評(píng)估

CT=klgX0+b

CT2—

CT1=（klgX02+b）—（klgX01+b）

CT2—

CT1=k(lgX02—lgX01)

CT2—

CT1=klg(X02/X01)當(dāng)擴(kuò)增效率為100時(shí)，K=-3.32，若CT相差1，則兩個(gè)樣品的濃度差異為：

lg(X02/X01)=(CT2—

CT1)/k當(dāng)擴(kuò)增效率為100時(shí)，K=-3.32，兩個(gè)樣品的濃度差異為10倍，則CT差異為：CT值差與模板量差的關(guān)系濃度增加1倍，CT值減小1個(gè)單位濃度增加10倍，CT值減小3.3個(gè)單位CT=klgX0+bCT2—CT1=（k熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見問題熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見問題病原體核酸檢測(cè)效果的主要影響因素樣品采集和儲(chǔ)運(yùn)核酸抽提核酸定量檢測(cè)采樣部位、保存液、凍融導(dǎo)致巨大差別的因素導(dǎo)致一般差別的因素交叉污染、抑制劑、病毒裂解引物、探針設(shè)計(jì)/合成質(zhì)量核酸的純度和完整性預(yù)混液的質(zhì)量樣品量樣品量、回收率儀器、循環(huán)條件病原體核酸檢測(cè)效果的主要影響因素樣品采集和儲(chǔ)運(yùn)核酸抽提核酸定實(shí)驗(yàn)污染反應(yīng)試劑質(zhì)量問題未正確密封而導(dǎo)致的試劑蒸發(fā)錯(cuò)誤的熒光染料設(shè)置錯(cuò)誤的反應(yīng)程序設(shè)置使用錯(cuò)誤的耗材熒光污染儀器硬件問題導(dǎo)致異常實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的常見原因:實(shí)驗(yàn)污染導(dǎo)致異常實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的常見原因:兩種容易混淆的陰性對(duì)照無(wú)模板的陰性對(duì)照

在反應(yīng)體系中不加入核酸模板，而以水為替代的對(duì)照目的：監(jiān)控配制反應(yīng)體系的試劑是否存在污染。陰性樣品的對(duì)照在樣品制備過程中，加入已知的陰性樣品（或水），并將提取物作為模板加入反應(yīng)體系，參與整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。目的：監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作過程中是否存在污染。兩種容易混淆的陰性對(duì)照無(wú)模板的陰性對(duì)照故障排除時(shí)提供有用信息的軟件界面故障排除時(shí)提供有用信息的軟件界面原始熒光組分曲線-v2.0原始熒光組分曲線-v2.0擴(kuò)增曲線-v2.0擴(kuò)增曲線-v2.0標(biāo)準(zhǔn)曲線-v2.0標(biāo)準(zhǔn)曲線-v2.0原始多通道熒光信號(hào)-v2.0原始多通道熒光信號(hào)-v2.0原始多通道熒光信號(hào)-v2.0原始多通道熒光信號(hào)-v2.0質(zhì)控報(bào)告-V2.0質(zhì)控報(bào)告-V2.0理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果案例1:是否存在擴(kuò)增？一些形狀和正常的擴(kuò)增曲線有區(qū)別的曲線，該如何判斷呢？正常的擴(kuò)增曲線平臺(tái)期很低可疑的擴(kuò)增曲線案例1:是否存在擴(kuò)增？一些形狀和正常的擴(kuò)增曲線有區(qū)別的曲線，這些曲線都有典型的指數(shù)增長(zhǎng)期，而且和其他的曲線平行（雖然比較短）。如何判斷它們是真正的擴(kuò)增？這些曲線都有典型的指數(shù)增長(zhǎng)期，而且和其他的曲線平行（雖然比較同時(shí)也具有特征性的三個(gè)增長(zhǎng)階段。如何判斷它們是真正的擴(kuò)增？同時(shí)也具有特征性的三個(gè)增長(zhǎng)階段。如何判斷它們是真正的擴(kuò)增？可能是目標(biāo)模板的濃度太低。通常如果模板的起始濃度太低,反應(yīng)體系會(huì)形成大量的引物二聚體。大量引物二聚體的形成使得引物很快消耗完，從而造成擴(kuò)增曲線的平臺(tái)期很低。是什么原因造成平臺(tái)期很低?可能是目標(biāo)模板的濃度太低。是什么原因造成平臺(tái)期很低?案例2:是否存在擴(kuò)增？?案例2:是否存在擴(kuò)增？?如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？首先，和同一反應(yīng)中的其他擴(kuò)增曲線相比，這些曲線的形狀不相同。如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？首先，和同一反應(yīng)中的其他擴(kuò)增曲線相同時(shí)，這些曲線都沒有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期。如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？同時(shí)，這些曲線都沒有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期。如何判斷它們是否存在擴(kuò)其次，看Y軸的數(shù)值。這些“可疑”曲線的指數(shù)增長(zhǎng)期范圍常常是落在1e-2的范圍內(nèi)。對(duì)數(shù)圖如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？其次，看Y軸的數(shù)值。對(duì)數(shù)圖如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？最后，查閱線性圖：曲線一直沒有指數(shù)上升的趨勢(shì)，提示不存在擴(kuò)增。輕微的熒光增長(zhǎng)可能來(lái)源于探針的降解。如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？最后，查閱線性圖：如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？案例3:是否存在擴(kuò)增？右側(cè)的曲線形狀和擴(kuò)增曲線很相似，但是曲線不光滑。案例3:是否存在擴(kuò)增？右側(cè)的曲線形狀和擴(kuò)增曲線很相似，但是曲切換到線性圖，可以看到曲線有一定的上升。如何判斷它們是否存在擴(kuò)增？切換到線性圖，可以看到曲線有一定的上升。如何判斷它們是否存在分析這些樣品在反應(yīng)的最后階段才開始擴(kuò)增，平臺(tái)期很接近背景。這些樣品的擴(kuò)增曲線出現(xiàn)了指數(shù)擴(kuò)增的區(qū)段雖然我們可以認(rèn)為這些樣品是臨界陽(yáng)性，但是對(duì)這些樣品的定量結(jié)果都是不太準(zhǔn)確的。形成這類曲線的原因可能是模板的質(zhì)量差(RT/PCR抑制物;模板濃度低)，也可能是引物探針的設(shè)計(jì)問題。試劑原因如果使用的試劑背景信號(hào)太強(qiáng)，熒光的增長(zhǎng)將會(huì)很小，導(dǎo)致擴(kuò)增曲線的指數(shù)增長(zhǎng)期會(huì)變得很短，或者沒有。熒光信號(hào)差的試劑也會(huì)有同樣的問題。分析這些樣品在反應(yīng)的最后階段才開始擴(kuò)增，平臺(tái)期很接近背景?？偨Y(jié)：遵循擴(kuò)增曲線形態(tài)第一，Ct值第二的判讀原則。查看MultiComponentPlot：是否有正常的陽(yáng)性擴(kuò)增曲線查看擴(kuò)增曲線的形狀：是否有明顯擴(kuò)增階段（指數(shù)增長(zhǎng)期）?指數(shù)圖下擴(kuò)增曲線間是否平行?查看Y軸的數(shù)值：擴(kuò)增曲