分子靶向藥物索拉非尼微晶制劑的制備及其對肝細(xì)胞癌的抑制作用

分子靶向藥物索拉非尼微晶制劑的制備及其對肝細(xì)胞癌的抑制作用

肝臟腫瘤是影響人們健康的嚴(yán)重危害。肝腫瘤（hj）是肝臟腫瘤中最重要的病理亞型，占肝臟腫瘤病理總數(shù)的95%以上。索拉非尼溶解度差,這嚴(yán)重影響其在人體的吸收與利用。利用索拉非尼溶解度差這一特性,本試驗利用球磨法等技術(shù),制備了索拉非尼的微晶制劑。進(jìn)展期肝細(xì)胞癌的主要特征是其較高的侵襲性與血管侵犯等,為更好地模擬和反映出進(jìn)展期肝細(xì)胞癌的生物學(xué)行為與臨床特征,我們選取了高侵襲性的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系MHCC97-H進(jìn)行實驗。索拉非尼微晶制劑為微米級粒徑的針狀晶體,將其進(jìn)行腫瘤組織瘤內(nèi)注射后能夠長時間留駐于腫瘤組織間隙,通過組織對其溶蝕作用實現(xiàn)索拉非尼的長效與緩釋。與索拉非尼的增溶制劑相比,索拉非尼微晶制劑單次給藥即能夠?qū)崿F(xiàn)對HCC腫瘤的抗腫瘤作用。1材料表面1.1實驗動物和試劑高侵襲性的HCC細(xì)胞系MHCC97-H(中科院上海細(xì)胞庫)。細(xì)胞培養(yǎng)使用的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿等(美國Corning公司);高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)等(美國Hyclone公司);qPCR實驗全套試劑(美國ABI公司)。實驗使用BalB/c免疫缺陷小鼠(北京維通利華公司),在清潔級動物房進(jìn)行飼養(yǎng)。吸入麻醉劑:異氟烷(isoflurane)(深圳瑞沃德公司);核素探針1.2pet/ct檢測qPCR儀(美國ABI公司);小動物麻醉劑機(jī)、PET/CT小動物活體成像系統(tǒng)以及蓋革計數(shù)器等(鄭州大學(xué)實驗動物中心);渦旋混勻器、磁力攪拌器球磨機(jī)等制劑設(shè)備由鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院藥學(xué)部提供。2實驗方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)與裸鼠皮下腫瘤實驗高侵襲性的肝細(xì)胞癌細(xì)胞系MHCC97-H置37℃,5%CO2.2超聲助溶劑制備索拉非尼的增溶制劑:索拉非尼純品,依次加入二甲亞砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG400)以及Tween80等有機(jī)溶劑,攪拌與超聲助溶。最后小心加入滅菌的去離子水(ddH制備索拉非尼的微晶制劑:使用ddH索拉非尼藥物粉末不溶于水,制備所得的藥物增溶制劑索拉非尼的載藥量為5mg·mL2.3托拉西泮腫瘤組織藥物“2.1”項下MHCC97-H皮下腫瘤經(jīng)過7~10d生長待其體積達(dá)到約1000mm2.4持續(xù)支撐wen80取10μL索拉非尼微晶制劑加入到含有0.1%Tween80以及0.9%NaCl的10mL去離子水中,置于渦旋振蕩器中進(jìn)行持續(xù)震蕩;在系列時間點(每日)以3000r·min2.5復(fù)配體中emt相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測收集前述各組皮下腫瘤,按照廠商說明書進(jìn)行實驗,提取腫瘤組織中的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI7500實時熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測,以β-actin為內(nèi)標(biāo),確定EMT相關(guān)上皮特征的標(biāo)識物E-Cadherin;以及2個間質(zhì)特征的標(biāo)識物N-cadherin、vimentin的表達(dá)水平。qPCR實驗中使用的引物序列為2.6小鼠肝臟pet/ct檢測各組皮下腫瘤,選取腫瘤組織表面性狀較好的部分,接種于免疫缺陷小鼠肝臟。待其在肝臟經(jīng)過3~4周生長后,進(jìn)行PET/CT檢測。具體試驗條件為:動物進(jìn)行吸入麻醉后,每只動物經(jīng)尾靜脈注射200μCi的2.7統(tǒng)計分析使用SPSS17.0軟件,采用單因素方差分析比較均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差方法計算P值。3結(jié)果3.1索拉非尼微晶制劑的體內(nèi)釋放情況制備得到的索拉非尼微晶制劑為針狀晶體,粒徑大約15μm左右(圖1A)。索拉非尼微晶制劑的體外釋放曲線見圖1B。在37℃條件下,索拉非尼微晶制劑能夠持續(xù)釋放12d以上。索拉非尼微晶制劑的體內(nèi)釋放情況見圖1C,D。腫瘤組織內(nèi)注射索拉非尼增溶制劑或微晶制劑,注射增溶制劑組動物血藥濃度在24h左右即達(dá)頂峰(圖1C),48h即基本清除完畢,這一結(jié)果與藥物在腫瘤組織中的留存量檢測一致(圖1D)。對索拉非尼微晶制劑,索拉非尼的血藥濃度一直維持在較低水平(圖1C),注射后12d腫瘤組織內(nèi)仍能夠檢測到索拉非尼的分布(圖1D)。這表明,索拉非尼的微晶制劑能夠?qū)崿F(xiàn)其在腫瘤組織局部的緩釋作用。3.2索拉非尼微晶制劑單次給藥即能夠抑制mh-h細(xì)胞在裸鼠治療的體積與重量腫瘤內(nèi)注射索拉非尼增溶制劑不能抑制MHCC97-H細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤作用,不影響MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠皮下形成腫瘤組織的體積與重量,見圖2;單次腫瘤內(nèi)注射索拉非尼微晶制劑即能夠?qū)崿F(xiàn)對腫瘤的抑制作用,顯著抑制MHCC97-H細(xì)胞在裸鼠皮下形成腫瘤組織的體積與重量。圖2A為腫瘤照片,2B和2C分別為腫瘤體積與腫瘤重量的結(jié)果。這表明,索拉非尼的微晶制劑能夠?qū)崿F(xiàn)在腫瘤組織內(nèi)長效抗腫瘤作用。3.3索拉非尼微晶制劑單次給藥后n-cadhenin的表達(dá)水平在皮下腫瘤組織中單次給予索拉非尼的增溶制劑不能夠影響瘤組織中腫瘤細(xì)胞上皮特征標(biāo)識物E-cadherin、以及間質(zhì)特征標(biāo)識物N-cadherin與vimentin的表達(dá)水平(圖3);單次腫瘤內(nèi)注射索拉非尼微晶制劑能夠上調(diào)腫瘤組織中E-cadherin的表達(dá)水平;下調(diào)N-cadherin與vimentin的表達(dá)。這表明,單次給予索拉非尼的微晶制劑即能夠抑制HCC細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用。3.4藥物處理對裸鼠肝臟原位的作用結(jié)果表明,索拉非尼微晶制劑能夠長效抑制HCC細(xì)胞皮下腫瘤的形成作用,同時抑制腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。為此,我們進(jìn)一步檢測了不同藥物處理組皮下腫瘤組織中細(xì)胞在裸鼠肝臟原位的成瘤作用,見圖4。在腫瘤內(nèi)給予索拉非尼微晶制劑能夠抑制腫瘤組織中HCC細(xì)胞在肝臟原位形成腫瘤病灶的大小,而腫瘤內(nèi)注射索拉非尼增溶制劑不能影響腫瘤組織中HCC細(xì)胞在肝臟原位形成腫瘤病灶的能力。這進(jìn)一步確證了索拉非尼微晶制劑的抗腫瘤活性。4索拉非尼-微晶制劑索拉非尼是目前唯一的進(jìn)展期HCC一線治療藥物,但其在臨床診療應(yīng)用中面臨諸