酶蛋白的結(jié)構(gòu)

酶蛋白的結(jié)構(gòu)酶蛋白的結(jié)構(gòu)第1頁酶蛋白的結(jié)構(gòu)第2頁酶蛋白的結(jié)構(gòu)第3頁酶蛋白的結(jié)構(gòu)第4頁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功效關(guān)系舉例：鐮刀狀細(xì)胞貧血病

鐮刀狀細(xì)胞貧血病是最早被認(rèn)識一個分子病，流行于非洲一些地域，患者紅細(xì)胞形態(tài)異常，有很多呈新月狀或鐮刀狀，在紅細(xì)胞脫氧時鐮刀狀細(xì)胞數(shù)量增加，嚴(yán)重時造成紅細(xì)胞破裂、溶血而致命。鐮刀狀紅細(xì)胞產(chǎn)生原因是患者血紅蛋白異常。血紅蛋白是紅細(xì)胞內(nèi)起攜帶氧氣功效一個主要蛋白質(zhì)，是一個四聚體蛋白質(zhì)，由兩個α亞基和兩個β亞基組成（α2β2），其中α亞基包含141個氨基酸殘基，β亞基包含146個氨基酸殘基。鐮刀狀細(xì)胞貧血病患者因為基因突變，其血紅蛋白（HbS）β亞基N-末端第6號位氨基酸由原來正常血紅蛋白（HbA）高度極性Glu變成了非極性Val酶蛋白的結(jié)構(gòu)第5頁這種改變造成血紅蛋白表面電荷降低，在脫氧狀態(tài)下溶解度下降，發(fā)生不正常聚集，形成鐮刀狀紅細(xì)胞，嚴(yán)重時造成紅細(xì)胞破裂。血紅蛋白分子共有574個氨基酸殘基組成，僅僅兩個β亞基上各改變了一個氨基酸殘基，生理功效就發(fā)生了如此大改變，可見蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)對功效影響之大。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第6頁牛胰核糖核酸酶復(fù)性試驗8個Cys－SH形成4個二硫鍵組合方式有7×5×3=105種，因而重新形成正確配正確概率僅1/105，酶蛋白的結(jié)構(gòu)第7頁第一節(jié)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)研究方法

1.蛋白質(zhì)分離純化和相對分子質(zhì)量測定2.確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目3.拆分并分離蛋白質(zhì)分子多肽鏈4.測定每條多肽鏈氨基酸組成5.多肽鏈N-末端和C-末端分析6.多肽鏈局部斷裂和肽段分離

7.測定各個肽段氨基酸次序8.確定肽段在多肽鏈中次序從而排列出多肽鏈氨基酸次序

9.多肽鏈中二硫鍵位置確實定酶蛋白的結(jié)構(gòu)第8頁1.蛋白質(zhì)分離純化和相對分子質(zhì)量測定電泳單一帶SDS測分子量（質(zhì)譜法）酶蛋白的結(jié)構(gòu)第9頁2.確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈數(shù)目末端分析法3.拆分并分離蛋白質(zhì)分子多肽鏈氧化法氧化法優(yōu)點在于二硫鍵一旦拆開，不會重新形成連接，但在氧化過程中伴伴隨一些副反應(yīng)，Met側(cè)鏈被氧化生成亞砜，Trp側(cè)鏈被破壞。

還原法為了預(yù)防游離巰基重新氧化，還需加入烷化劑如碘乙酸，使巰基上發(fā)生取代反應(yīng)而不會重新被氧化

酶蛋白的結(jié)構(gòu)第10頁酶蛋白的結(jié)構(gòu)第11頁4.測定每條多肽鏈氨基酸組成蛋白質(zhì)完全水解：要求完全水解且不破壞氨基酸1）酸水解：

作水解程度時間圖確定最正確時間1-10mg蛋白樣品→加HCl→抽真空→封閉→烘箱特點：a）Trp完全破壞，生成不溶性物質(zhì)b）

Ser、Thr、Tyr個別破壞，Ser破壞10-15%，Thr、Tyr破壞5-10%，應(yīng)給予校正c）

Asn→AspGlu→Glnd）

胱氨酸→半胱氨酸e）

大個別氨基酸不破壞酶蛋白的結(jié)構(gòu)第12頁2）堿水解：特點：a)Trp不破壞b）大個別氨基酸破壞酶蛋白的結(jié)構(gòu)第13頁分離檢測：1）紙層；2）薄層；3）離交；4）氨基酸自動分析儀酶蛋白的結(jié)構(gòu)第14頁5.多肽鏈N-末端和C-末端分析目標(biāo)：有幾條肽鏈；N、C末端是何氨基酸

測不出末端幾個原因：蛋白質(zhì)分子為環(huán)肽；末端被保護(hù)試劑保護(hù)；末端是Pro5-1N端測定（介紹原理、分離檢測方法和優(yōu)缺點）1）FDNB法（Sanger法；2.4-二硝基氟苯法）a）原理：酶蛋白的結(jié)構(gòu)第15頁b)分離檢測：乙醚萃取，DNP-Aa溶于乙醚而Aa不溶標(biāo)準(zhǔn)Aa+DNP——反應(yīng)——紙層——噴茚三酮未知DNP-Aa-——紙層——噴茚三酮比較即得結(jié)果，若結(jié)果是兩點以上則證實是有幾條肽鏈組成c）優(yōu)點：反應(yīng)條件溫和，末端產(chǎn)物易分離缺點：N端是Pro測不出；不能進(jìn)行N端測序Lys另一氨基生成e-DNP-Lys，因為它不溶于乙醚故不影響測定結(jié)果酶蛋白的結(jié)構(gòu)第16頁2)丹磺酰氯法（DNS法）

a)原理：酶蛋白的結(jié)構(gòu)第17頁b）分離檢測：DNS-Aa溶于乙酸乙酯，Aa不溶標(biāo)準(zhǔn)Aa+DNS——反應(yīng)——紙層——熒光顯色未知DNS-Aa-——紙層——熒光顯色比較即得結(jié)果，若結(jié)果是兩點以上則證實是有幾條肽鏈組成c）優(yōu)點：靈敏度高；是前種方法100倍；用量少，樣品量為0.1-2ng

缺點：DNS-Pro、DNS-Try被破壞；N端是Pro、Try測不出；不能進(jìn)行N端測序酶蛋白的結(jié)構(gòu)第18頁3)Edman降解法[苯異硫氰酸酯法（PITC法)]a)原理：

a）分離檢測：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶c）優(yōu)點：N端是Pro可測；能進(jìn)行N端測序缺點：靈敏度稍差酶蛋白的結(jié)構(gòu)第19頁4）DansyCl-Edman法既可檢測N端序列又有較高靈敏度

酶蛋白的結(jié)構(gòu)第20頁5)亮氨酸氨肽酶法

此酶專一水解N端羧基形成肽鍵，可測N端序列，但不能測N端為Pro.酶蛋白的結(jié)構(gòu)第21頁5-2C-末端分析

C-末端分析方法也有很多，但至今還不能令人滿意，常見有肼解法、還原法、羧肽酶法等。1）肼解法原理：

酶蛋白的結(jié)構(gòu)第22頁b）分離檢測：苯甲醛+酰肼→沉淀→離心上清液中含游離基酸

2)還原法用還原劑如硼氫化鋰處理肽鏈，則C-末端殘基α-羧基被還原成醇，將肽鏈完全水解后，分析水解產(chǎn)物，其中α-氨基醇對應(yīng)即為C-末端氨基酸。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第23頁3)羧肽酶法羧肽酶是一個專一從多肽鏈C-末端開始逐一水解氨基酸殘基蛋白水解酶。因為該酶專一性，當(dāng)它作用于多肽鏈時，C-末端殘基首先被水解下來，然后是C-末端第二個氨基酸殘基，依這類推。依據(jù)氨基酸釋放動力學(xué)曲線，能夠確定C-末端氨基酸以及靠近C-末端幾個氨基酸排列次序。不過這是理想情況，實際測定中經(jīng)常有各種原因干擾，極難確定C-末端多個氨基酸排列次序。

羧肽酶A：a）Lys、His、Arg在C-末端不能水解

b）C-末端是Pro不能水解c）C-末端第二個是Pro，不論第一個是何氨基酸都不能水解羧肽酶B：a）水解C-末端為Lys、His、Argb）C-末端第二個是Pro，不論第一個是何氨基酸都不能水解酶蛋白的結(jié)構(gòu)第24頁6.多肽鏈局部斷裂和肽段分離在氨基酸次序測定時，只要從肽鏈某一末端（通常是N-末端）起逐一將氨基酸殘基斷裂下來，并對游離出來氨基酸或其衍生物進(jìn)行判定，就能夠確定氨基酸序列。不過實際操作時，因為每次末端氨基酸殘基發(fā)生斷裂效率不能到達(dá)100%，或者說，在大多數(shù)肽段在斷裂第二個氨基酸殘基時，少數(shù)肽段可能因為上一輪未發(fā)生反應(yīng)而正在斷裂第一個氨基酸殘基，這么勢必給測定帶來干擾。假如肽鏈很短，這么干擾不會對測定產(chǎn)生重大影響；但蛋白質(zhì)肽鏈長度都超出這一范圍，這么測定將無法進(jìn)行下去。所以大家首先需將肽鏈進(jìn)行適當(dāng)分解，將其斷裂成若干長度適當(dāng)肽段，再分別測定這些肽段氨基酸次序。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第25頁1．溴化氰裂解法：BrC≡N：專一水解Met羧基形成鍵優(yōu)點：專一性強(qiáng)，切點少，產(chǎn)率高（85%）

*弱酸、弱堿也可使肽鏈水解但專一性不好2．酶解法：胰酶：水解堿性氨基酸羧基所形成鍵（Lys，Arg）*堿性氨基酸羧基連接是Pro則不能水解。糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：專一性水解芳香族氨基酸羧基所形成鍵（Phe，Try，Tyr）。*若芳香族氨基酸羧基連接是Pro則不能水解。

分離肽鏈可用：分子篩；離子交換；等點聚焦（電泳法）酶蛋白的結(jié)構(gòu)第26頁酶蛋白的結(jié)構(gòu)第27頁7.測定各個肽段氨基酸次序測定肽段氨基酸次序方法有：Edman降解法、酶解法、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)使用方法等，其中最常使用是Edman降解法。Edman降解法原理是利用前述苯異硫氰酸酯（PITC），又稱Edman試劑與N-末端氨基酸殘基α-氨基之間特異性反應(yīng)，每輪反應(yīng)后N-末端氨基酸脫落，并生成PTH-氨基酸。經(jīng)過層析等方法判定PTH-氨基酸種類，就能夠確定肽鏈中對應(yīng)位置氨基酸。經(jīng)過n輪反應(yīng)，即可確定由肽段中N-末端起n個氨基酸次序。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第28頁酶蛋白的結(jié)構(gòu)第29頁酶蛋白的結(jié)構(gòu)第30頁8.確定肽段在多肽鏈中次序從而排列出多肽鏈氨基酸次序至此，已經(jīng)得出了多肽鏈被斷裂成各個肽段氨基酸次序，但因為沒有這些肽段在多肽鏈中次序信息，還是無法排出整個多肽鏈氨基酸次序。為此，必須用兩種或者兩種以上方法來斷裂多肽鏈，比如用兩種蛋白酶分別水解多肽鏈，將得到兩套斷裂位點不一樣肽段，分別確定這兩套肽段氨基酸次序，然后利用這兩套肽段氨基酸次序彼此之間有交織重合，能夠確定整條多肽鏈氨基酸次序。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第31頁經(jīng)過末端分析得到：N-末端殘基為I，C-末端殘基為L用胰蛋白酶水解得到第一套肽段，測定出氨基酸次序分別為：

MTYAGK

ISR

EAL

CAFR

DALK用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段，測定出氨基酸次序分別為：

TY

REAL

AGKDAL

ISRM

KCAF酶蛋白的結(jié)構(gòu)第32頁因為N-末端殘基為I，ISR和ISRM是N-末端肽段；又因為C-末端殘基為L，EAL和REAL是C-末端肽段。利用兩套肽段氨基酸次序彼此之間重合關(guān)系，得出：第一套肽段：N-末端ISR

MTYAGK

DALK

CAFR

EALC-末端第二套肽段：N-末端ISRM

TY

AGKDAL

KCAF

REALC-末端推出完整肽鏈次序：

ISRMTYAGKDALKCAFREAL在上例中，兩套肽段之間恰好能夠相互跨過切口而重合，從而能確定出肽段在多肽鏈中位置，拼湊出整條肽鏈氨基酸次序。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第33頁9.多肽鏈中二硫鍵位置確實定對于含有二硫鍵蛋白質(zhì)，咱們在分析多肽鏈氨基酸次序前先將其拆開，然而在測定完多肽鏈氨基酸次序后需要確定鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵位置，常見方法是對角線電泳法。不拆開二硫鍵直接用蛋白酶水解蛋白質(zhì)，所得肽段樣品點樣到濾紙中央電泳原點，在第一個方向上進(jìn)行電泳，則不一樣肽段按其所帶電荷和分子大小分離。結(jié)束后將濾紙在過甲酸蒸氣中熏，二硫鍵被氧化和拆開。將濾紙旋轉(zhuǎn)90°，在相同條件下進(jìn)行第二個方向上電泳。這時，對于不含二硫鍵肽段，因為沒有發(fā)生改變，電泳遷移率不變，電泳后位置應(yīng)處于對角線上；而含有二硫鍵肽段，其大小和電荷發(fā)生了改變，電泳遷移率也要改變，電泳后位置偏離對角線，將這些肽段提取出來，進(jìn)行氨基酸次序分析，與已經(jīng)測定多肽鏈氨基酸次序相比較，即可推斷出二硫鍵位置。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第34頁酶蛋白的結(jié)構(gòu)第35頁除了上述經(jīng)典蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定方法外，因為核苷酸序列測定技術(shù)發(fā)展快速，當(dāng)前DNA核苷酸序列測定已完全實現(xiàn)自動化，而蛋白質(zhì)氨基酸次序是由DNA所決定，大家經(jīng)過提純指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成mRNA，再將mRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄作用得到cDNA，并擴(kuò)增cDNA，然后測定其核苷酸序列，依據(jù)三聯(lián)體遺傳密碼規(guī)則可確定出蛋白質(zhì)氨基酸次序。到當(dāng)前為止，已經(jīng)有10萬種以上蛋白質(zhì)完成了一級結(jié)構(gòu)測定，對于大多數(shù)常見蛋白質(zhì)，經(jīng)過查閱數(shù)據(jù)庫，可得到關(guān)于一級結(jié)構(gòu)資料。

酶蛋白的結(jié)構(gòu)第36頁第二節(jié)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)研究方法二級結(jié)構(gòu)：a-螺旋（a-helix)

；b-片層(β-sheet)

；b-轉(zhuǎn)角(β-turn)

；無規(guī)卷曲(random)維持鍵：氫鍵、疏水鍵、范德華力、離子鍵、配位鍵等R基團(tuán)對a-螺旋影響：a)組成a-螺旋要求R不太大，不帶電荷b）幾個相連氨基酸R帶同種電荷，不形成a-螺旋c）R帶電荷但間斷，可形成a-螺旋酶蛋白的結(jié)構(gòu)第37頁*φ=-57°，Ψ=-47°是形成a-螺旋條件，不滿足此條件不能形成a-螺旋*Gly不參加a-螺旋，原因：Glya-C上連兩個H，故φ、Ψ無法確定*Pro、Hyp不參加a-螺旋，原因：不形成φ角；空間障礙不形成氫鍵φ=-119°，Ψ=+113°時，蛋白質(zhì)分子成平行b-片層φ=-139°，Ψ=+135°時，蛋白質(zhì)分子成反平行b-片層從能量上看，反平行式要比平行式更穩(wěn)定。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第38頁

三級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)深入卷曲形成,含有三級結(jié)構(gòu)蛋白普通為球形或橢球形纖維蛋白含有超二級結(jié)構(gòu)(超螺旋)四級結(jié)構(gòu)含有獨立三級結(jié)構(gòu)間結(jié)構(gòu)酶蛋白的結(jié)構(gòu)第39頁晶體蛋白測定X光衍射——古老方法，1958年英國科學(xué)家開始利用，分辨率6A0，當(dāng)前分辨率1.4A0，我國X光衍射儀分辨率1.8A0，測胰島素結(jié)構(gòu)。缺點：只能測晶體，不能測溶液。不能測氫原子位置，故測不出氫鍵作用。只能測靜態(tài)酶結(jié)構(gòu)，無法測酶催化反應(yīng)動態(tài)。當(dāng)前有較新試驗方法——中子衍射。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第40頁溶液中構(gòu)象測定a)紫外吸收法（常見方法）：Try，Tyr，Phe在紫外波長范圍有最大光吸收，產(chǎn)生紫外吸收光譜。受pH、溶劑或鄰近分子、鄰近發(fā)色團(tuán)相對取向影響。當(dāng)前用紫外吸收法能夠探討以下問題：芳香族氨基酸在表面？在內(nèi)部？極性環(huán)境？非極性環(huán)境？數(shù)量？(氨基酸由極性到非極性，λ，ε上升。極性溶液中，氨基酸在蛋白中，λ，ε大于游離時，一定在蛋白內(nèi)部且被非極性氨基酸包圍。極性改變對λ，ε影響大，氨基酸一定在表面。）外界條件影響，二級、三級結(jié)構(gòu)有沒有改變？改變過程？酶蛋白的結(jié)構(gòu)第41頁b)熒光光譜法Tyr，Try，Phe能發(fā)射熒光。最大熒光強(qiáng)度波長為348nm、303nm、282nm，發(fā)光強(qiáng)度Try：Tyr：Phe=100：9：0.5。故普通以Try為準(zhǔn)，熒光靈敏度是紫外103——104倍。用熒光光譜法可研究蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變、酶活性部位結(jié)構(gòu)、Try和Tyr殘基微環(huán)境、蛋白質(zhì)變性。蛋白位于極性溶劑時，λmax短波，Try進(jìn)入蛋白內(nèi)部非極性區(qū)。蛋白位于非非極性溶劑，λmax短波，Try到蛋白表面。紫外測值，純酶需配成0.5mg/ml熒光測值，純酶需配成0.035mg/ml研究酶活性部位普通要引入一個熒光探針.此試劑要求與酶結(jié)合牢靠、不影響底物結(jié)合。探針在水中，熒光很小；在非極性中增大。例：酶+熒光標(biāo)識底物：熒光強(qiáng)度上升，峰值移向短波,酶活部位是疏水區(qū)酶蛋白的結(jié)構(gòu)第42頁c)園二色譜法（CD譜）CD光譜圖：遠(yuǎn)紫外區(qū)185nm——245nm，吸光是肽鍵所致，故可看出主鏈，可算出α-螺旋、β-折疊含量。近紫外區(qū)245nm——320nm，吸光是Tyr、Trp、Phe所致，故可看出芳香族氨基酸所在微環(huán)境。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第43頁至今為止大家還無法做到直接觀察蛋白質(zhì)分子中原子和原子團(tuán)排列，光學(xué)顯微鏡最大分辨率在0.2μm，而蛋白質(zhì)分子內(nèi)各原子之間距離在0.1nm左右。當(dāng)前大家對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究都是借助于一些輻射方法，常見包含X-射線衍射法、核磁共振、熒光光譜法、旋光色散、圓二色性、拉曼光譜、掃描隧道顯微技術(shù)、原子力顯微技術(shù)，等等。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第44頁例1氨基酸組成Phe+Pro+2Lys+GluEdman降解PTH—Glu，胰酶，羧肽酶A、B均不可水解成氨基酸或小肽，求次序。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第45頁例2：A肽經(jīng)酸解得:Lys+His+Asp+2Glu+Ala+Val+Tyr+2NH3。經(jīng)FDNB得DNP—Asp

經(jīng)羧肽酶得Val

經(jīng)胰酶得（1）Lys+Asp+Glu+Ala+Tyr（PH6.4是等電點）（2）His+Glu+Val（PH6.4帶+電荷）（2）經(jīng)FDNB得DNP—His。經(jīng)胰凝乳蛋白酶得（1）Asp+Ala+Tyr（PH6.4中性）（2）Lys+His+2Glu+Val（PH6.4帶+電荷）求次序。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第46頁例3（1）肽經(jīng)酸解得Try+Ala+Arg+2Ser+Lys+Phe+Met+Pro（2）肽經(jīng)FDNB法得DNP—Alaε-DNP-Lys（3）肽經(jīng)羧肽酶A不能測出C-末端氨基酸（4）肽經(jīng)羧肽酶B不能測出C-末端氨基酸（5）肽經(jīng)溴化氰得Ser+Try+Pro；Ala+Arg+Ser+Lys+Phe+Met（6）肽經(jīng)胰凝乳蛋白酶（chT）得Ser+Pro；Met+Try；Phe+Lys+Ser+Arg+Ala（7）肽經(jīng)胰酶（T）得Ala+Arg；Lys+Ser；Phe+Try+Met+Ser+Pro

求次序。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第47頁例1答案：Glu-Phe-Lys-Pro-Lys解法：PTH—GluN-末端為Glu，胰酶不水解故有Lys—Pro羧肽酶A不水解：Lys為C末端，Pro為C末端，Pro為C末端第二。羧肽酶B不水解：Pro為C末端第二。故Pro為C末端第二。故有Glu-Phe-Lys-Pro-Lys或Glu-Lys-Lys-Pro-Phe若是后一個胰酶可將其水解成Glu-Lys，Lys-Pro-Phe，而試驗顯示胰酶不水解，故只能是第一個情況。酶蛋白的結(jié)構(gòu)第48頁例2答案：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val解法：酸講解明Asp和2Glu中有兩個是以酰胺狀態(tài)存在

FDNB得N-末端是Asp

羧肽酶得C-末端是Val

胰酶水解堿性氨基酸羧基所形成鍵，且在His+Glu+Val中His為