綠色銀光蛋白

綠色銀光蛋白綠色銀光蛋白第1頁Osamu

Shimomura

Martin

Chalfie

Roger

Y.

Tsien

（錢永?。?/p>

年10月8日，美Woods

Hole海洋生物學試驗室下村修、哥倫比亞大學馬丁-沙爾菲和加州大學圣地亞哥分校錢永健三位美國科學家，因為在水母中發(fā)覺和研究綠色熒光蛋白而取得年諾貝爾化學獎。綠色銀光蛋白第2頁

GFP發(fā)覺之旅；

1962年，下村修首次從維多利亞多管水母Aequorea

victoria中分離出GFP。他發(fā)覺該蛋白在紫外線下會發(fā)出明亮綠光。

1992年，道格拉斯·普瑞舍克隆并測定了水母中綠色熒光蛋白基因。

1993年，Martin

Chalfie證實了GFP作為各種生物學現(xiàn)象發(fā)光遺傳標識價值。在最初一項試驗中，他用GFP使秀麗隱桿線蟲6個單獨細胞有了顏色。

1994年，錢永健開始改造熒光蛋白，培育出黃色、藍色、綠色、紅色等各種顏色熒光蛋白，了解了GFP發(fā)出熒光機制。世界上當前使用熒光蛋白大多是錢永健試驗室改造后變種。令在同一時間跟蹤多個不一樣生物學過程成為現(xiàn)實。錢永健還開發(fā)了檢測熒光蛋白熒光探針技術。綠色銀光蛋白第3頁維多利亞多管水母（Aequorea

victoria）綠色銀光蛋白第4頁GFP介紹

維多利亞多管水母生活在北太平洋嚴寒水域。這種水母體內(nèi)含有一個生物發(fā)光蛋白質(zhì)——aequorin，它本身發(fā)藍光。GFP能把這種光轉(zhuǎn)變成綠色，也就是當水母容光煥發(fā)時候咱們實際看到顏色。GFP純?nèi)芤涸诮?jīng)典室光下呈黃色，不過當被拿到戶外陽光下時，它會發(fā)出鮮綠顏色。這種蛋白質(zhì)從陽光中吸收紫外光，然后以能量較低綠光形式發(fā)射出來。綠色銀光蛋白第5頁GFP結(jié)構(gòu)蛋白序列SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGIGFP由238個氨基酸殘基組成，分子量約為26.9kDa。綠色銀光蛋白第6頁GFP結(jié)構(gòu)GFP結(jié)構(gòu)綠色銀光蛋白第7頁GFP結(jié)構(gòu)綠色銀光蛋白第8頁GFP結(jié)構(gòu)GFP結(jié)構(gòu)綠色銀光蛋白第9頁GFP晶體結(jié)構(gòu)顯示,蛋白質(zhì)中央是一個圓柱形水桶樣結(jié)構(gòu),長420nm,寬240nm,由11個β片層組成桶狀組成疏水中心和由4個α螺旋以及其中一個α螺旋包含著發(fā)光基團組成。

GFP結(jié)構(gòu)綠色銀光蛋白第10頁GFP結(jié)構(gòu)桶頂部由3個短垂直片段覆蓋,底部由一個短垂直片段覆蓋,對熒光活性很主要生色團則位于大空腔內(nèi)。嚴密桶形結(jié)構(gòu)保護著熒光基團，預防它被周圍環(huán)境淬滅。試驗表明GFP熒光產(chǎn)生前提是桶狀結(jié)構(gòu)完整性,去除N端6個氨基酸或C端9個氨基酸,GFP均會失去熒光。這是因為生色團形成效率較低,而且形成過程受外界環(huán)境影響較大緣故綠色銀光蛋白第11頁GFP結(jié)構(gòu)GFP結(jié)構(gòu)綠色銀光蛋白第12頁GFP獨特結(jié)構(gòu)由238個氨基酸組成“像一個罐頭”每個單體由11個反向平行

-sheets圍繞，4個

-helix組成，其中一個

-helix位于“罐頭”內(nèi)大約長420nm,寬240nm熒光基團位于關鍵

-helix綠色銀光蛋白第13頁GFP結(jié)構(gòu)綠色銀光蛋白第14頁由α螺旋含有發(fā)光基團由第65、66、67位絲氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色團組成。翻譯出蛋白質(zhì)折疊環(huán)化之后,在O2存在下,分子內(nèi)第67位甘氨酸酰胺對第65位絲氨酸羧基親核攻擊形成第5位碳原子咪唑基,第66位酪氨酸α2β鍵脫氫反應之后,造成芳香團與咪唑基結(jié)合。這么,GFP分子中形成對羥基苯甲酸咪唑環(huán)酮生色團,該過程能夠自動催化完成。綠色銀光蛋白第15頁綠色銀光蛋白第16頁1.兩個野生型GFP吸收紫外光和藍光，發(fā)射綠光，在395nm出現(xiàn)一個最大吸收峰,在470nm出現(xiàn)一個小吸收。出現(xiàn)兩個吸收峰原因可能是因為存在陰性和中性兩個不一樣化學結(jié)構(gòu)生色團。因為存在兩個吸收峰,野生型GFP能夠被標準長波紫外源和異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)所激發(fā)。GFP性質(zhì)綠色銀光蛋白第17頁2.能夠在單獨或者與其它蛋白融合時產(chǎn)生熒光。而其最顯著特點是除了氧氣之外，不需要其它輔酶，不需底物。3.Baird等研究人員發(fā)覺，即使GFP有緊密桶狀結(jié)構(gòu)和形成發(fā)光基團所必需復雜翻譯后修飾，當對GFPN端和C端個別交換重排并以一段間隔重新連接時，GFP依然含有熒光。而且，GFP一些位點能夠耐受整段蛋白插入，在結(jié)合金屬離子黃色熒光蛋白（YellowFluorescentProtein,YFP，GFP突變體）中145位插入鋅指結(jié)構(gòu)能使熒光強度多倍提升。綠色銀光蛋白第18頁4.GFP作為匯報分子含有很多優(yōu)點，如實現(xiàn)了活細胞內(nèi)基因表示和定位、熒光為蛋白內(nèi)在屬性、熒光發(fā)射無種屬依賴性、熒光信號對光漂白含有高抗性、檢測時不需要附加輔助因子、在細菌和真核細胞中表示無顯著毒性、含有高度穩(wěn)定性。另外，細胞內(nèi)GFP檢測也比較簡單，如利用紫外燈、熒光顯微鏡、熒光激活細胞分選儀等，現(xiàn)有報道利用實時定量PCR進行GFP熒光定量測定方法。綠色銀光蛋白第19頁GFP應用1.在蛋白質(zhì)相互作用和構(gòu)型改變研究中應用一個活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究方法是蛋白質(zhì)片斷互補測定法（protein-fragmentcomplementationassay,PCA）。將標識蛋白在某個位點打開，用片斷分別標識兩個蛋白。假如被標識蛋白質(zhì)相互作用，則酶或熒光蛋白片斷靠近并重新折疊恢復活性。

Hu等提出了雙分子熒光互補試驗（BiFC）概念，用互補熒光片斷標識不一樣蛋白來研究bZIP和Rel轉(zhuǎn)錄因子家族相互作用，確定了相互作用位置，信號傳遞對作用位點調(diào)整等。

綠色銀光蛋白第20頁

熒光互補不但僅在蛋白質(zhì)相互作用中有所應用，Jeong等研究人員以與底物結(jié)合時會有經(jīng)典構(gòu)象改變麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）為模型，將MBPC端和N端分別與GFP片斷融合。結(jié)果證實加入底物一組顯示出比對照組更強熒光，由此提出split-GFP在觀察蛋白構(gòu)型改變中應用。另外，一個主要熒光成像技術—熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）也被廣泛應用。它能夠利用GFP及其突變體青色熒光蛋白（CFP）、黃色熒光蛋白（YFP）等，定時、定量、定位、無損傷地在活細胞內(nèi)檢測大分子構(gòu)象改變、蛋白之間相互作用、信號傳遞路徑。綠色銀光蛋白第21頁2.GFP在信號轉(zhuǎn)導中應用研究發(fā)覺,一些突變GFP能夠發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），F(xiàn)RET對于兩個熒光分子相互間定位和距離高度敏感(在納米范圍內(nèi))。兩個分子間微小線性或空間定位關系破壞能夠強烈地改變能量轉(zhuǎn)移效率。經(jīng)過計算供給分子對于接收分子熒光釋放比率來觀察細胞動態(tài)改變指標。它消除了GFP分子在絕對濃度、細胞厚度、激發(fā)源能量度以及檢測絕對效率等影響。利用FRET能夠作成GFP依賴生物探針,現(xiàn)已經(jīng)有研究人員設計大分子或分子配對物來改變GFP之間原有生理信號反應FRET。綠色銀光蛋白第22頁

在上述試驗基礎上,研究人員設計了FRET依賴Ca2+敏感指示劑,該試驗發(fā)覺,經(jīng)過改變兩個GFP之間距離,可增加FRET。另有一些研究人員,并沒有把兩個GFP融合在一個單一結(jié)構(gòu)中,而是把一個GFP融合到CaM上,另一個GFP融合到CaM結(jié)合區(qū)域。結(jié)果發(fā)覺,當Ca2+結(jié)合到CaM上,出現(xiàn)分子間異源二聚體,兩個GFP足夠靠近而產(chǎn)生FRET。這個試驗提醒了FRET不但能夠在分子內(nèi)發(fā)生,而且還可在分子間發(fā)生。綠色銀光蛋白第23頁

最近,有學者用GFP依賴生物傳感器測量活細胞內(nèi)生化動力學,經(jīng)過利用帶有GFP標識蛋白激酶A轉(zhuǎn)染細胞,觀察相關cAMP動態(tài)熒光改變。經(jīng)過融合藍色熒光GFP到調(diào)整亞單位或融合綠色熒光GFP到PKA催化亞單位,設計出了cAMP傳感器。當cAMP濃度很低時,兩個熒光分子距離很近,并出現(xiàn)FRET,假如增加cAMP濃度,發(fā)生FRET可能性急劇下降。利用該方法,能夠檢測出cAMP動態(tài)改變,并開創(chuàng)了在整體條件下,研究cAMP調(diào)整信號轉(zhuǎn)導路徑新方法。綠色銀光蛋白第24頁GFP結(jié)構(gòu)即使含有高度完整性,不過試驗中發(fā)覺,在GFP中一些確定位置,插入外源基因,完全沒有喪失其熒光性。當把CaM插入黃色熒光GFP突變體中,得到Ca2+

傳感器,當Ca2+

結(jié)合到CaM上,造成生色團去質(zhì)子化,使熒光強度增加7倍。當在黃色熒光GFP中插入一個Zif268鋅指結(jié)構(gòu),能夠得到傳導Zn2+

GFP,結(jié)果發(fā)覺熒光少許增加,為改變前1.7倍,Kd值約0.4mmol。插入外源基因致使GFP熒光敏感性增強現(xiàn)象,提供了一個獲取永久編碼傳感器去監(jiān)測細胞信號轉(zhuǎn)導新路徑。綠色銀光蛋白第25頁改進GFP應用前景

藍色熒光蛋白、青色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，褐色。。。。。。1.提升了GFP光譜性質(zhì)，2.提升熒光強度3.提升光穩(wěn)定性4.顏色突變5.pH敏感突變體

綠色銀光蛋白第26頁

到當前為止,改進熒光蛋白已經(jīng)有非常廣泛應用,如轉(zhuǎn)染細胞確實定,體內(nèi)基因表示測定,蛋白質(zhì)分子定位和細胞間分子交流動態(tài)監(jiān)測,免疫分析、核酸堿基探針分析,以及分子間第二信使鈣離子和cAMP水平指示,細胞間隙pH改變檢測。另外,GFP也能夠和其它蛋白質(zhì)形成融合蛋白,作為基因治療檢測指標。但GFP在應用中還發(fā)覺有許多問題亟待處理:(1)熒光信號強度非線性性質(zhì)使得定量非常困難。

(2)多數(shù)生物含有微弱自發(fā)熒光現(xiàn)象,并有著類似激發(fā)和發(fā)射波長,這個熒光背景會影響一些GFP檢測。

(3)試驗中發(fā)覺極難建成GFP穩(wěn)定細胞株,可能與GFP參加細胞凋亡過程相關。綠色銀光蛋白第27頁詳細研究領域1、骨架和細胞分裂2、細胞器動力學和泡囊運輸3、發(fā)育生物學4、神經(jīng)生物學5、其它應用6、GFP載體和技術7、其它有用GFP鏈接

綠色銀光蛋白第28頁應用GFP研究結(jié)果美新奧爾良科學家培育出世界首只能在“黑暗處發(fā)光”貓

綠色銀光蛋白第29頁杰夫·利希曼利用熒光蛋白展現(xiàn)了大腦內(nèi)連接，圖片中漂亮“彩虹”就是神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡

1997年在大阪大學降生第一