lamp法檢測克氏原螯蝦白斑綜合征病毒的研究

lamp法檢測克氏原螯蝦白斑綜合征病毒的研究

對照組波形病毒（wssv）是線頭病毒科（nimavirius）的唯一成員。目前對WSSV的診斷方法主要包括病理學(xué)觀察、流式細胞術(shù)方法、免疫學(xué)方法、生物學(xué)方法以及PCR方法等1材料和方法1.1感染蝦的來源自然感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦取自江蘇省南京市的一個暴發(fā)白斑綜合征的蝦養(yǎng)殖場,由江蘇省水生動物疫病預(yù)防控制中心提供。1.2兩種反應(yīng)條件的優(yōu)化1.2.1在檢測過程中使用的dns模型的制備本研究使用的方法是根據(jù)Kono的熱提取法1.2.2引物的合成根據(jù)已公布的WSSVORF131序列(GenBank登錄號:EF524223)合成引物。4條引物分別為:(1)FIP。包括F1.3巢式pcr檢測wssv法根據(jù)WSSVORF234(GenBank登錄號:AF332093)序列設(shè)計,用于檢測WSSV巢式PCR的2對引物分別是2個外引物P1.4lamp與巢式pcr檢測wssv靈敏度的比較通過快速煮沸法,用感染W(wǎng)SSV的病蝦組織制備DNA樣品,按照10倍梯度稀釋后分別作為LAMP和巢式PCR的模板,進行擴增反應(yīng),其結(jié)果分別用2%和1%瓊脂糖凝膠電泳進行比較,以確定兩者檢測WSSV的靈敏度差異。2結(jié)果與分析2.1lamp反應(yīng)條件的優(yōu)化分別用快速煮沸法和苯酚/氯仿法制備的檢測樣品作為模板,在60、63、65℃環(huán)境下進行LAMP反應(yīng),其結(jié)果經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳顯示效果見圖2。當(dāng)反應(yīng)溫度為65℃時,無論是用快速煮沸法還是用苯酚/氯仿法制備的模板,均沒有檢測到LAMP的擴增條帶;而在63℃反應(yīng)條件下,兩者均可擴增出清晰的條帶;當(dāng)反應(yīng)溫度為60℃時,用快速煮沸法制備的樣品進行LAMP也可以獲得非常滿意的結(jié)果,用苯酚/氯仿法制備的樣品經(jīng)擴增后可以出現(xiàn)陽性結(jié)果,但擴增效果有明顯差異?？傮w上說,63℃是該反應(yīng)的最佳溫度,用快速煮沸法制備模板的LAMP效果優(yōu)于用苯酚/氯仿法制備模板。用快速煮沸法制備的DNA檢測樣品作為模板,進一步考察在63℃條件下反應(yīng)時間對LAMP的影響。由圖3可知,反應(yīng)時間為30min時沒有可供分辨的條帶產(chǎn)生,當(dāng)反應(yīng)時間延長為45min時開始有較清晰的條帶出現(xiàn),并隨著反應(yīng)時間的延長,其LAMP產(chǎn)物也相應(yīng)增加,當(dāng)反應(yīng)時間延長到75min時效果最好,其后時間再進一步延長對LAMP擴增沒有促進作用;陰性對照組經(jīng)90min反應(yīng),并沒有觀察到條帶產(chǎn)生。此外,同樣通過快速煮沸法,用病蝦組織制備的DNA模板進行LAMP反應(yīng)來評估甜菜堿在本反應(yīng)中的影響。在反應(yīng)體系中分別加入初始濃度為10mol/L的甜菜堿1.25、2.5、3.75μL時,LAMP反應(yīng)的電泳條帶都不夠清晰或檢測不到。相反,當(dāng)反應(yīng)體系中不添加甜菜堿時,其LAMP可擴增出非常清晰的條帶。結(jié)果發(fā)現(xiàn),優(yōu)化后檢測WSSVORF131的LAMP反應(yīng)條件是63℃孵育75min,并且反應(yīng)體系中不須添加甜菜堿(圖4)。2.2lamp與巢式pcr檢測極限的比較用LAMP檢測WSSV的反應(yīng)時間在45min后即可獲得可分辨的條帶,所以在比較試驗中,LAMP的反應(yīng)時間確定為45min。將通過快速煮沸法從病蝦組織中制備總DNA檢測樣品,按照10倍梯度稀釋后作為模板,分別進行LAMP和巢式PCR反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳顯示,分別用稀釋了103lamp反應(yīng)條件的優(yōu)化用PCR方法檢測WSSV技術(shù)成熟,具有一定的靈敏度,但是存在需要專業(yè)PCR儀、反應(yīng)時間較長等缺點,因而在一定程度上限制了它在實際檢測中的應(yīng)用。LAMP法操作簡單,無需專業(yè)PCR儀,檢測靈敏度高,試驗耗時短,只要1h左右即可完成擴增反應(yīng)在制備用于供檢測用的核酸模板時,其方法在簡繁間差距甚大。有先將WSSV病毒從病蝦組織中完全純化出來,再提取DNA用于LAMP進行擴增,可以得到滿意的結(jié)果很多LAMP反應(yīng)的時間都被優(yōu)化為1h左右。Kono等提出,在檢測日本對蝦中WSSV的LAMP優(yōu)化反應(yīng)條件為65℃、1h,反應(yīng)45min后會有很好的擴增效果考慮到甜菜堿曾被報道可以通過幫助DNA發(fā)生構(gòu)象變化促進DNA與酶的結(jié)合而有利于擴增反應(yīng)的進行白斑綜合征是以感染蝦在甲殼內(nèi)側(cè)出現(xiàn)白色斑點為主要特征,所以主要通過觀察蝦體是否出現(xiàn)白斑、行動是否變得遲緩等明顯患病癥狀來初步判斷蝦是否感染了WSSV。但是僅依靠出現(xiàn)白色斑點和蝦的行動來診斷容易出現(xiàn)誤診或是對早期感染而不出現(xiàn)白斑癥狀的病蝦無從鑒定。本研究簡化了用于檢測的DNA模板制備步驟,經(jīng)優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)具高靈敏性、特異性、檢測時間短等特點。而用該方法可以快