基因診療醫(yī)學(xué)知識講座

基因診療醫(yī)學(xué)知識講座基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第1頁第一節(jié) 基因診療概念 及常見技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第2頁基因診療—利用分子生物學(xué)技術(shù)，從 DNA/RNA水平檢測基因存在,分析基因結(jié)構(gòu)變異和表示狀態(tài)，從而對疾病作出診療。一、基礎(chǔ)概念基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第3頁二、基因診療常見方法㈠ 核酸分子雜交㈡ PCR㈢ DNA序列測定㈣ DNA芯片技術(shù)基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第4頁(一) 核酸雜交基礎(chǔ)原理-------核酸變性和復(fù)性理論

即雙鏈核酸分子在一些理化原因作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對規(guī)律形成雙鏈結(jié)構(gòu)。所以應(yīng)用已知堿基序列單鏈核苷酸片段作為探針，就可檢測樣本中是否存在與其互補同源核苷酸序列?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第5頁probeprobe基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第6頁核酸雜交關(guān)鍵要素probeDNAtargetDNAsignaldetection基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第7頁核酸雜交方法分類按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。固相雜交是將參加反應(yīng)一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應(yīng)核酸游離在溶液中。液相雜交所參加反應(yīng)兩條核酸鏈都游離在溶液中?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第8頁固相雜交分類Southern印記雜交Northern印記雜交斑點雜交原位雜交基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第9頁Southernblot是最經(jīng)典基因分析方法，不但能檢出特異DNA片段，而且能進行定量和測定分子量，可用于基因酶切圖譜分析、基因突變分析等。基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第10頁Northern雜交用于RNA檢測，能對組織細胞中總RNA或mRNA進行定性和定量分析?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第11頁斑點雜交（Dotblot）

可用基因組中特定基因及其表示定性及定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點是不能判定所測基因分子量，特異性不高，有一定百分比假陽性?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第12頁原位雜交

（Colonyinsituhybridization）

可查明染色體中特定基因位置，用于染色體疾病診療；原位雜交結(jié)果是顯示相關(guān)核酸序列空間位置情況，所以可檢出含核酸序列詳細細胞，細胞詳細定位，數(shù)目和類型，可檢出基因和基因產(chǎn)物亞細胞定位?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第13頁（二）利用PCR及結(jié)合其它技術(shù)進行基因診療直接采取PCR進行基因診療采取PCR產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLPs）進行基因診療采取PCR結(jié)合等位基因特異性寡核苷酸探針（ASO）斑點雜交進行基因診療*經(jīng)過PCR產(chǎn)物反相點雜交(RBD)進行基因診療采取PCR產(chǎn)物單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)分析進行基因診療采取PCR技術(shù)對靶核酸進行定量分析基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第14頁寡核苷酸雜交分析SNP和等位基因特異寡核苷酸雜交（ASO）#基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第15頁（三）DNA序列測定

DNA序列測定是進行基因突變檢測最直接、最準確方法，能夠確定突變部位，突變性質(zhì)?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第16頁（四）DNA芯片技術(shù)

應(yīng)用DNA芯片，能夠檢測基因結(jié)構(gòu)及其突變多態(tài)性，對基因表示情況進行分析。基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第17頁二基因診療特點高特異性高靈敏度取得穩(wěn)定結(jié)果早期快速適用性強，應(yīng)用范圍廣基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第18頁第二節(jié)遺傳病基因診療基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第19頁一、概述人類遺傳病達數(shù)千種地中海貧血在意大利等國家發(fā)病率達10％鐮狀細胞貧血在美國黑人中發(fā)病率達14％我國常見遺傳性疾病有地中海貧血、異常血紅蛋白病和血友病。有效治療難；經(jīng)過基因診療進行攜帶者篩查，產(chǎn)前早期診療，降低發(fā)病率?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第20頁二、鐮狀細胞貧血血紅蛋白?。ó惓Ｑt蛋白病）紅細胞呈鐮刀狀，壽命短，引發(fā)溶血性貧血。患者多在成年以前死亡基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第21頁×MstⅡ酶切位點(CCTNAGG)5′3′正?；?′3′突變基因1.15kb1.35kb（一）鐮狀紅細胞貧血分子機制5 6 7--Pro Glu Glu—--CCT

GAG

GAG--5 6 7--Pro Ala Glu—--CCT

GTG

GAG--基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第22頁（二）鐮狀細胞貧血基因診療方法限制性內(nèi)切酶/Southernblot

采集制備血液DNA→內(nèi)切酶MstⅡ消化→電泳→轉(zhuǎn)膜→32P標識β珠蛋白cDNA雜交→放射自顯影基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第23頁+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者基因組限制性酶切分析基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第24頁PCR/限制性內(nèi)切酶設(shè)計引物→PCR擴增→產(chǎn)物進行限制性內(nèi)切酶酶切→電泳→EB染色→直接觀察例：引物1：5’-GGGCTGGGCATAAAAGTCA-3’引物2：5’-AATAGACCAATAGGCAGAG-3’

擴增產(chǎn)物294bp鐮狀細胞貧血基因診療方法基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第25頁引物1CCT

GAG

GAGCCT

GTG

GAG引物1引物2引物2294bp103bp191bpMstⅡ酶切位點(CCTNAGG)基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第26頁+﹣103bp191bp294bp正常人突變攜帶著患者鐮狀紅細胞貧血患者PCR產(chǎn)物限制性酶切分析基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第27頁RT-PCR/序列分析

采集制備血液RNA→RT-PCR→產(chǎn)物測序→推測氨基酸序列→進行診療鐮狀細胞貧血基因診療方法基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第28頁二、β－地中海貧血

(β－Thalassaemia,簡寫βthal或βT)β珠蛋白基因突變造成該多肽鏈合成大為降低（β＋）或完全缺失（β0）β珠蛋白合成速率降低，造成β鏈和α鏈合成不平衡→多出珠蛋白鏈沉積在紅細胞膜上→改變了膜通透性和硬度→造成溶血性貧血。高危人群地中海人、中東人、印度人、中國人；中國人群中又一廣東、廣西、四川、貴州等省發(fā)病率最高。缺乏有效治療辦法?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第29頁（一）β地貧病分子基礎(chǔ)β珠蛋白基因全長2053bp，含2個內(nèi)含子（IVS－I和IVS-II），3個外顯子。當前發(fā)覺突變有百余種，中國人群發(fā)覺約20種；普通對特定種族來說，90%β地貧基因僅由4～6種突變組成。基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第30頁（二）β地中海貧血基因診療PCR/ASO斑點雜交法 合成2對PCR引物（擴增區(qū)段700bp和580bp，分別包含14種和1種可能突變）→合成等位特異寡核苷酸(ASO)探針（4～6對，分別標識） →制備DNA樣品 →PCR擴增 →斑點印跡雜交RFLP分析法基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第31頁三α地中海貧血基因診療ac左側(cè)缺失4.2kb右側(cè)缺失3.7kbbbbaα2α1α1α2N端α1C端正?；蛐蛄蠵CR擴增法——定性分析左側(cè)缺失型基因序列右側(cè)缺失型基因序列ac擴增0.4kbab無擴增片段ab擴增1.2kb基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第32頁+﹣0.4kb1.2kb正常人右側(cè)缺失患者地中海貧血患者基因組PCR分析左側(cè)缺失患者基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第33頁四、杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）

1.DMD是常見性連鎖隱性遺傳病，

2.主要特征是進行性肌萎縮和腸肌假性肥大，XP21.21—21.3區(qū)抗肌萎縮蛋白基因突變形式不一樣。

DMD多在5歲發(fā)病，10歲左右癱瘓，在20歲左右因為心力和呼吸衰竭而死亡，其發(fā)病率為活產(chǎn)男嬰1/3500。

基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第34頁（一）DMD分子基礎(chǔ)：

抗肌萎縮蛋白基因長約2900kb，含79個外顯子。抗肌萎縮蛋白基因突變分為基因缺失型和非基因缺失型。（1）DNA片段缺失（60%病例→造成閱讀框移碼→移碼實變→致DMD，整碼缺失→BMD）。缺失2個熱點區(qū)①該基因5’端處②45~55外顯子范圍內(nèi)。（2）非基因缺失型個別重復(fù)（病例5%）基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第35頁（1）基因組探針法 用XP21區(qū)分離得到不一樣探針如（P20）來進行對應(yīng)內(nèi)切酶酶譜分析、檢出率取決于探針數(shù)和酶切位點數(shù)目。（2）cDNA探針法 抗肌萎縮蛋白基因系列cDNA探針分析患者基因缺失、外顯子拼接改變和基因內(nèi)個別重復(fù)。（3）多重PCR法 如有些人設(shè)計多對引物進行多重PCR擴增該基因9個易發(fā)缺失“熱點區(qū)”DNA片段，可檢出80%有基因缺失DMD患者。（4）多態(tài)性分析法 基因內(nèi)及其旁側(cè)探針進行RFLP連鎖分析。（5）RT—PCR擴增該基因外顯子（全長2.4MB、外顯子起來全長c14kb、用多對引物）可檢出：外顯子拼接異常。聯(lián)用測序：可定位基因缺失起始和終止?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第36頁1、苯丙酮尿癥是一個常見隱性遺傳性氨基酸代謝病。2、主要特征：（1）苯丙氨酸酪氨酸→多巴→兒茶酚胺苯丙酮酸酪胺黑色素

（2）患兒出生后須及早得到低phe飲食治療，不然發(fā)生不可逆大腦損害和嚴重智力發(fā)育障礙。

苯丙氨酸羥化酶↓（肝）五、苯丙酮尿癥（PKU）基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第37頁（一）PKU分子基礎(chǔ)（1）迄今約3/4造成中國人PKU突變基因已被查清，它們分屬11種PAH基因點突變。體外研究表明，這些突變造成PAH活力↓或喪失。（2）PAH第11外顯子第399密碼GTA（val）→GTT（val）中性突變：①不改變?nèi)魏蜗拗泼缸R別位點，故又稱“序列多態(tài)性”。②這一“序列多態(tài)性”在PKU患者和正常人中存在著連鎖不平衡性，故可作為一個“遺傳標識”應(yīng)用于產(chǎn)前診療?；蛟\療醫(yī)學(xué)知識講座第38頁①PCR/ASO探針法和PCR-RFLP連鎖分析法。②PCR/SSCP③直接測序法—若待診療PKU家系基因突變類型尚屬“未知”或無RFLP信息。（二）PKUDNA診療基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第39頁先合成ASO如： 正常探針： TCCATTAACAGTAAGAATTT

突變探針： TCCATTAACAATAAGAATTT利用PCR/ASO探針法診療苯丙酮尿癥基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第40頁利用PCR/ASO探針法診療苯丙酮尿癥▽◎△▲ ○◎△健康男性 ▽男性攜帶者

▲男性患者○健康女性 ◎女性攜帶者 ●女性患者●▽正常探針突變探針基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第41頁第三節(jié)腫瘤基因診療基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第42頁1 經(jīng)過檢測腫瘤染色體易位及融合基因診療腫瘤 慢粒：（染色體易位）費城染色體

PCR檢測融合基因

2 檢測腫瘤相關(guān)基因癌基因（ras）、抑癌基因（

p53）、腫瘤轉(zhuǎn)移基因3 檢測腫瘤相關(guān)病毒基因

HBVHCV－肝癌

EB－鼻咽癌4 檢測腫瘤標志物基因或mRNA

肝癌—甲胎蛋白（AFP）結(jié)腸癌—癌胚抗原（CEA）腫瘤基因診療策略基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第43頁腫瘤標識物基因檢測著絲粒

染色體22bcrgenec-ablgene

染色體9

bcr-mRNA

bcr-abl

mRNA

染色體9,22

bcr-abl

融合蛋白（具PTK活性）

慢性骨髓白血病

引物A引物B基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第44頁2 癌基因和抑癌基因檢測㈠ras癌基因檢測ras基因中最常見點突變是第12，13或61密碼子突變檢測方法：PCR/ASOPCR-SSCP基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第45頁㈡p53檢測p53基因突變主要為點突變，熱點區(qū)域位于密碼子130~290，以175、273、284最多見檢測方法：PCR—SSCPPCR—測序PCR—RFLP基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第46頁㈢其它基因檢測PCR結(jié)合其它技術(shù)基因芯片基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第47頁4、腫瘤標志物檢測或mRNA診療腫瘤標志物 是由腫瘤組織細胞產(chǎn)生、與腫瘤形成和發(fā)展相關(guān)物質(zhì)，包含腫瘤抗原、激素、酶、同工酶等。基因標志和基因表型標志（胚胎性抗原）檢測方法：PCR—ASOPCR—測序PCR—RFLPPCR－SSCP基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第48頁第四節(jié)感染性疾病

基因診療基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第49頁一、感染性疾病基因

診療策略針對病原體特異核酸序列設(shè)計探針進行雜交應(yīng)用PCR技術(shù)擴增病原體基因保守序列核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第50頁特點簡便、特異、快捷能檢測出潛在病原體可對病原體進行分類、分型判定不能得知病原體進入體內(nèi)后機體反應(yīng)基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第51頁二、基因診療感染性疾病（一）、病毒特點：分離培養(yǎng)—周期長，操作繁雜，制約原因多電鏡觀察—直觀快速，但昂貴免疫學(xué)診療—簡便快速，但存在問題：不易檢出潛伏期病毒有些病毒亞型多，抗原變異性大整合進入人基因組病毒基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第52頁病毒核酸分析技術(shù)HBV—包含4個開放閱讀框，S、C、P、X PCR PCR/限制性內(nèi)切酶譜分析

PCR/點雜交, PCR/Southernblot

基因芯片目標基因引物序列擴增片段C5’ACTGTTCAAGCCTCCAAGCT3’425bp5’AGTGCGAATCCACACTC3’基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第53頁

調(diào)整和開啟轉(zhuǎn)錄LTRgagpolenv

tat，revLTR

長末端重復(fù)序列調(diào)整蛋白基因正常病毒基因產(chǎn)生病毒關(guān)鍵蛋白產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶

產(chǎn)生病毒外膜蛋白附加基因*HIV病毒基因組結(jié)構(gòu)基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第54頁目標基因引物序列擴增片段env5’ACAATTATTGTCTGGTATAG3’135bp5’AGGTATCTTTCCACAGCCAG3’HIV-1ProbeTGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAGPCR/核酸雜交診療艾滋病基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第55頁SARS——RT－PCR

多重PCR

熒光定量PCR基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第56頁（二）、細菌細菌性痢疾——志賀菌，侵襲性大腸桿菌，大質(zhì)粒；PCR結(jié)核病——PCR

基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第57頁（三）、寄生蟲重復(fù)序列探針法、寡核苷酸探針法、基因組探針法、PCR基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第58頁第五節(jié)基因診療策略基因診療醫(yī)學(xué)知識講座第59頁（一）檢測致病基因突變基因變異致病類型：內(nèi)源基因變異基因結(jié)構(gòu)突變點突變、插入、缺失、重排、異位