超聲波協(xié)同流水凈化對活體克氏原螯蝦攜帶菌量及菌相構(gòu)成的影響

超聲波協(xié)同流水凈化對活體克氏原螯蝦攜帶菌量及菌相構(gòu)成的影響

元浩蝦通常被稱為小龍蝦，具有清新、美麗、獨特的口感。它是一種高品質(zhì)的低脂肪和蛋白食品，深受消費者歡迎?？耸显r原產(chǎn)于北美洲,是我國目前養(yǎng)殖范圍最廣的淡水螯蝦種類。近年來,江浙滬地區(qū)大中城市的年小龍蝦消費量都在萬噸以上,僅江蘇地區(qū)小龍蝦產(chǎn)品(蝦仁和整肢龍蝦)出口量達5500t1材料和方法1.1動物、試劑和生工生物克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)樣品來源于揚州本地的生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司,平均質(zhì)量為(39.5±1.5)g/只。營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基廣州環(huán)凱生物試劑有限公司;蛋白酶K、10×Buffer、dNTPs、Taq酶、DNAMarker、細菌16SrDNA擴增引物(8F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和15R:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)、隨機引物(AP31:5’-AGGGGTCTTG-3’)生工生物工程(上海)股份有限公司;其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2儀器、儀器與儀器BS210S型電子天平北京賽多利斯天平有限公司;KQ5200超聲波洗滌器昆山市超聲儀器有限公司;FSH-2型可調(diào)高速勻漿機金壇市榮華儀器制造公司;UV-2401PC紫外分光光度計日本島津公司;TG16-WS型臺式高速離心機湘儀離心機儀器有限公司;SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋日本Tommy公司;DGX-9053B-2型生化培養(yǎng)箱上海?，攲嶒炗邢薰?ABI2720熱循環(huán)儀美國LifeTechnologies公司;DYYSB型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京市六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)法國VilberLourmat公司。1.3方法1.3.1樣品采集從捕撈不超過2h的克氏原螯蝦中,挑選色澤均一、體格健碩、活力強的個體,加冰塊保藏并運送到實驗室后立即實驗。1.3.2超聲凈化處理隨機選取10只克氏原螯蝦測定起始帶菌量,其余蝦隨機分成3組,每組30只放入3只容量10L的超聲波洗滌器(40kHz,160W),將凈水器過濾的自來水接入洗滌池,調(diào)節(jié)水流量為45L/h,凈化時間為12h。處理組1不加超聲波處理;處理組2在2h超聲處理1次,持續(xù)時間120s;處理組3在2、6h超聲處理2次,持續(xù)時間均為120s,凈化過程中每隔4h取樣1次,每次10只用于菌落總數(shù)測定。1.3.3菌落鹽水的制備將克氏原螯蝦頭尾分開,無菌條件下分別取腮部,腸道以及尾部的殼與肉部分,將取下的三部分樣品分別稱質(zhì)量后參考文獻[13]的方法與滅菌生理鹽水按1∶10(m/V)的比例混合并勻漿,無菌吸取勻漿1mL用滅菌生理鹽水做10倍遞增稀釋。選擇5個連續(xù)稀釋度,每個稀釋度取250μL涂布營養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基,每個稀釋度涂布2個培養(yǎng)皿,倒置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)36h,人工計數(shù)并計算菌落總數(shù)(CFU/g),實驗重復3次,取平均值表示樣品中的菌落總數(shù)。1.3.4培養(yǎng)條件確定每個樣品選擇3個分離良好(菌落數(shù)在100~300CFU/g之間,菌落無黏連)的菌落計數(shù)平板挑取單菌落,每個平板隨機挑取總菌落數(shù)的10%~15%,挑取的單菌落在營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上劃線純化,挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基,37℃條件下培養(yǎng)24h,培養(yǎng)物進行標號后加15%甘油于-70℃條件下凍存?zhèn)溆谩?.3.5烷基三甲基溴化銨細菌基因組DNA的提取方法參照文獻[14]所述的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyltrimethyammoniumbromide,CTAB)法提取。1.3.6rapd擴增菌株之間的基因型差異通過RAPD指紋圖譜鑒別。以細菌基因組DNA為模板,應用AP31隨機引物進行RAPD擴增。將DNA提取物用ddH1.3.7聚類分析聚類分析根據(jù)在指紋圖譜中同一遷移率位點上的擴增條帶的“有”和“無”進行數(shù)字化處理,用“1”表示“有”,“0”表示“無”,建立矩陣,應用DPS7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中的0-1系統(tǒng)聚類分析程序,選擇Nei氏遺傳距離和類平均法進行聚類分析。1.3.8dntps1.以基因組DNA為模板進行16SrDNA的PCR擴增。PCR反應體系(50μL)包括:模板(50ng/μL)2.0μL、dNTPs(10mmol/L)2.0μL、25pmol/μL引物8F和15R各2.0μL、10×Buffer5.0μL、MgCl2結(jié)果與分析2.1蝦殼和腸腺菌落總數(shù)的比較由圖1A可知,蝦殼+肉中的菌落總數(shù)為6.64(lg(CFU/g)),由圖1B、1C可知,腮部和腸腺中的菌落總數(shù)顯著高于蝦殼+肉,達到7.18、7.22(lg(CFU/g)),總體帶菌水平略低于李明彥2.2kr1-1kr1-84e,嘴唇部分根據(jù)1.3.4節(jié)方法,共分離獲得218個分離株,其中凈化前分離菌落蝦殼+肉部分52個(編號為KR1-1~KR1-52),腮部分61個(編號為TS1-1~TS1-61);凈化后分離菌落蝦殼+肉部分49個(編號為KR3-1~KR3-49),腮部分56個(編號為TS3-1~TS3-56),所有菌落通過劃線純化后保種。2.3指紋譜的結(jié)果將所有分離株提取基因組DNA,結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取物OD2.416rdna測試序列的確定研究表明RAPD指紋圖譜可以應用于鑒別種內(nèi)差異2.5racd因子3個品種cincio結(jié)合菌株指紋圖譜的分布和測序鑒定結(jié)果,對超聲波協(xié)同流水處理前后克氏原螯蝦攜帶菌群的構(gòu)成進行分析,結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示超過50%的種群在凈化以后不能被檢測到,表明超聲波協(xié)同流水處理極大地減少了蝦殼肉和腮中攜帶的細菌種群數(shù)量,在蝦殼+肉部分,起始菌群中包括13個RAPD譜型,凈化以后能檢測到的只有6個RAPD型,分別屬于Pseudomonasputida、Psychrobacterglacincola、Shewanellabaltica、Flavobacteriumgranuli、Shewanellaputrefaciens、Aeromonassobria6個種。在克氏原螯蝦的腮部起始菌群極具多樣性,能夠檢出18個RAPD型,凈化以后只能檢測到9個RAPD型,分別屬于Aeromonaspiscicola、Aeromonassobria、Aeromonashydrophila、Pseudomonasputida、Psychrobacterglacincola、Enterobactercloacae、Flavobacteriumgranuli、Shewanellaputrefaciens8個種,其中Aeromonassobria、Enterobactercloacae、Flavobacteriumgranuli和Shewanellaputrefaciens是凈化以后克氏原螯蝦中殘留的優(yōu)勢種群,這4種細菌廣泛分布于土壤和水體環(huán)境中,是魚類等水生動物疾病的重要病原菌3細菌分離和種內(nèi)減菌克氏原螯蝦攜帶高水平的好氧和兼性好氧細菌,殼+肉部分攜帶量為6.64(lg(CFU/g)),腮部和腸腺中達到7.18、7.22(lg(CFU/g)),流水凈化可以降低克氏原螯蝦中的細菌載量,處理12h后,腮部細菌總數(shù)降低最多,達到1.05(lg(CFU/g))。超聲波處理能夠顯著促進流水凈化過程中的細菌減少,兩次超聲處理使蝦殼肉、腮部和腸道中細菌載量最終降低2.18、2.23、1.01(lg(CFU/g)),表明超聲波協(xié)同流水處理對活克氏原螯蝦的蝦殼+肉和腮部具有良好的減菌效果?？耸显r攜帶菌群構(gòu)成具有高度種屬和分子多樣性,主要包括不動桿菌屬、氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、黃桿菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬以及Comamonas屬,其中氣單胞菌屬、黃桿菌屬、嗜冷桿菌屬、希瓦氏菌屬和腸桿菌屬細菌為優(yōu)勢菌群。超聲處理協(xié)同流水凈化能有效降低蝦殼肉和腮部攜帶的好氧和兼性好氧細菌種群數(shù)量,50%以上的種群在凈化以后不能被