用軟件設(shè)計(jì)引物

使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶(如形成引物二聚體帶)，不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行，軟件的立足點(diǎn)也是按照引物設(shè)計(jì)的基本原則，只是更加快速和自動(dòng)化而已。我們可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，如著名的primer3(/),得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專業(yè)軟件。一般來說，專門進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)的專業(yè)軟件功能更為強(qiáng)大，但使用起來卻不太容易。軟件的引物設(shè)計(jì)功能主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先是引物分析評(píng)價(jià)功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做到，其中以'Oligo6”最優(yōu)秀；其次是引物的自動(dòng)搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同，因此自動(dòng)搜索的結(jié)果也不盡相同。據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，自動(dòng)搜索功能以“PremierPrimer”為最強(qiáng)且方便使用，“Oligo6”其次，其他軟件如“VectorNTISuit”、“DNAsis”、“Omiga”和“Dnastar”都帶有引物自動(dòng)搜索功能，但搜索結(jié)果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。筆者認(rèn)為引物設(shè)計(jì)軟件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”軟件合并使用，以“Premier”進(jìn)行自動(dòng)搜索，“Oligo”進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，如此可快速設(shè)計(jì)出成功率很高的引物。PrimerPremier5.0的使用技巧簡(jiǎn)介功能“Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì)、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析和DNA基元(motif)查找?！癙remier”還具有同源性分析功能，但并非其特長(zhǎng)，在此略過。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，另外還有序列“朗讀”、DNA與蛋白序列的互換、語(yǔ)音提示鍵盤輸入等等。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA來設(shè)計(jì)引物，由于大多數(shù)氨基酸(20種常見結(jié)構(gòu)氨基酸中的18種)的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA序列時(shí)，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì)并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點(diǎn)有所變化，稱之為簡(jiǎn)并引物。遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的。“Premier”可以針對(duì)模板DNA的來源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核(CiliateMacronuclear)、無脊椎動(dòng)物線粒體(InvertebrateMitochondrion)、支原體(Mycoplasma)、植物線粒體(PlantMitochondrion)、原生動(dòng)物線粒體(ProtozoanMitochondrion)、一般標(biāo)準(zhǔn)(Standard)、脊椎動(dòng)物線粒體(VertebrateMitochondrion)和酵母線粒體(YeastMitochondrion)。使用步驟及技巧其主要功能在主界面上一目了然。限制性酶切點(diǎn)分析及基元查找功能比較簡(jiǎn)單，點(diǎn)擊該功能按鈕后，選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶或基元(如-10序列，-35序列等)，按確定即可。常見的限制性內(nèi)切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制性內(nèi)切酶或基元。進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，打開DNA序列后點(diǎn)擊按鈕primer，出現(xiàn)“searchcriteria”窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目的(SeachFor)有三種選項(xiàng)，PCR引物(PCRPrimers)，測(cè)序引物(SequencingPrimers)，雜交探針(HybridizationProbes)。搜索類型(SearchType)可選擇分別或同時(shí)查找上、下游引物(Sense/Anti-sensePrimer，或Both)，或者成對(duì)查找(Pairs)，或者分別以適合上、下游引物為主(CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer)。另外還可改變選擇區(qū)域(SearchRanges),弓I物長(zhǎng)度(PrimerLength)，選擇方式(SearchMode)，參數(shù)選擇(SearchParameters)等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。如果沒有特殊要求，建議使用默認(rèn)設(shè)置。然后按search，隨之出現(xiàn)的SearchProgress窗口中顯示SearchCompleted時(shí)，再按0K,這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物(Sense),下游引物(Anti-sense),成對(duì)顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對(duì)方式，并按優(yōu)劣次序(Rating)排列，滿分為100,即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)。點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，如第1#引物，并把上述窗口挪開或退出，顯示“PeimerPremier”主窗口，所得結(jié)果分三部分，最上面是圖示PCR模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin),二聚體(Dimer)，錯(cuò)誤引發(fā)情況(FalsePriming)，及上下游引物之間二聚體形成情況(CrossDimer)。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由變成，點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應(yīng)用。在需要對(duì)引物進(jìn)行修飾編輯時(shí)，如在5'端加入酶切位點(diǎn)，可點(diǎn)擊，然后修改引物序列。若要回到搜索結(jié)果中，則點(diǎn)擊按鈕。如果要設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，只需根據(jù)源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī)則，反推至DNA序列即可。對(duì)簡(jiǎn)并引物的分析不需像一般引物那樣嚴(yán)格?？傊?，“Premier”有優(yōu)秀的引物自動(dòng)搜索功能，同時(shí)可進(jìn)行部分指標(biāo)的分析，而且容易使用，是一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的軟件。下 載 鏈 接 ：/self.aspx/software/oligo6.65.rarOligo6.22使用技巧簡(jiǎn)介1.功能在專門的引物設(shè)計(jì)軟件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表嚇倒。Oligo5.0的初始界面是兩個(gè)圖：Tm圖和AG圖；Oligo6.22的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了個(gè)Frq圖。“Oligo”的功能比“Premier'還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能風(fēng)靡全世界。2?使用(以O(shè)ligo6.22為例)Oligo6.22的啟動(dòng)界面顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為Tm、AG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，為鄰近6至7個(gè)堿基組成的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo5.0,只是顯示更清楚了。在設(shè)計(jì)時(shí)，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺得合適，可點(diǎn)擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕，選好上游引物，此時(shí)該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的G值在5'端和中間值比較高，而在3'端相對(duì)低。Tm值曲線以選取72°C附近為佳，5'到3'的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。Frq曲線為“Oligo6”新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3'端Frq值相對(duì)較低的片段。當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)并根據(jù)評(píng)價(jià)對(duì)引物進(jìn)行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3'端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成(crossdimer)。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測(cè)(非克隆)性PCR，對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來說，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過4.5為好。當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低。這種PCR需要通過靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果PCR的模板不是基因組DNA,而是一個(gè)特定模板序列，那么最好還進(jìn)行Falseprimingsite的檢測(cè)。這項(xiàng)檢查可以看出引物在非目的位點(diǎn)引發(fā)PCR反應(yīng)的可能性。如果引物在錯(cuò)配位點(diǎn)的引發(fā)效率比較高，就可能出假陽(yáng)性的PCR結(jié)果。一般在錯(cuò)配引發(fā)效率以不超過100為好，但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效率為130，那么這對(duì)引物也是可以接受的。當(dāng)我們結(jié)束以上四項(xiàng)檢測(cè)，按Alt+P鍵彈出PCR窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)。由于“Oligo”軟件的引物自動(dòng)搜索功能與“PrimerPremier5”的相類似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再贅述。其實(shí)，使用軟件自動(dòng)搜索引物就是讓計(jì)算機(jī)按照人的要求去尋找最佳引物，如果參數(shù)設(shè)置得當(dāng)將大大提高工作效率。3. 下 載 鏈 接 ：http://cid-6431dec21ba3f8f8.skydrive」i/self.aspx/software/Primer%20Premier%205.rar除了本地引物設(shè)計(jì)軟件之外，現(xiàn)在還有一些網(wǎng)上引物設(shè)計(jì)軟件，如由WhiteheadInstitute開發(fā)的“Primer3”等。該軟件的獨(dú)特之處在于，對(duì)全基因組PCR的引物設(shè)計(jì)；可以將設(shè)計(jì)好的引物對(duì)后臺(tái)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)并排除可引發(fā)錯(cuò)配的引物。因此建議經(jīng)常做全基因組PCR的用戶試用。用軟件設(shè)計(jì)引物(PrimerPremier&Oligo)細(xì)節(jié)補(bǔ)充在NCBI上搜索到我們感興趣的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對(duì)象。一：使用PrimerPremier5打開PrimerPremier5，點(diǎn)擊File-New-DNAsequenee,出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy目的序列在輸入框內(nèi)(選擇As)，此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點(diǎn)擊Primer，進(jìn)入引物窗口。此窗口可以鏈接到“引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search按鈕，進(jìn)入引物搜索框，選擇“PCRprimers”，“Pairs”，設(shè)定搜索區(qū)域和引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度；在SearchParameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，但產(chǎn)物長(zhǎng)度可以適當(dāng)變化，因?yàn)?00?200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300?500bp；點(diǎn)擊OK,軟件即開始自動(dòng)搜索引物，搜索完成后，會(huì)自動(dòng)跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評(píng)分（Rating）排序，點(diǎn)擊其中任一個(gè)搜索結(jié)果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息等。對(duì)于引物的序列，可以簡(jiǎn)單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3'端不要以A結(jié)尾，最好是G或者C，T也可以；3'不要出現(xiàn)連續(xù)的3個(gè)堿基相連的情況，比如GGG或CCC，否貝U容易引起錯(cuò)配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應(yīng)該在55?70度之間，GC%應(yīng)該在45%?55%間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯(cuò)誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級(jí)結(jié)構(gòu)，點(diǎn)擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應(yīng)該都不存在這些二級(jí)結(jié)構(gòu)，即這幾個(gè)按鈕都顯示為“None”為好。但有時(shí)很難找到各個(gè)條件都滿足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比如引物存在錯(cuò)配的話，可以就具體情況考察該錯(cuò)配的效率如何，是否會(huì)明顯影響產(chǎn)物。對(duì)于引物具體詳細(xì)的評(píng)價(jià)需要借助于Oligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5。在Primer5窗口中，若覺得某一對(duì)引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點(diǎn)擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Currentpair,使用PDF虛擬打印機(jī)，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細(xì)信息；或是選擇菜單欄下的savetodatabase保存起來。二：使用Oligo在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇Open,定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經(jīng)被保存為Seq文件），會(huì)跳出來兩個(gè)窗口，分別為InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點(diǎn)擊最左下角的按鈕，會(huì)出來引物定位對(duì)話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長(zhǎng)度可以通過點(diǎn)擊Change—Currentoligolength來改變。定位后，點(diǎn)擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點(diǎn)擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強(qiáng)大的引物分析功能了。Analyze中,第一項(xiàng)為Keyinfo,點(diǎn)擊Selectedprimers，會(huì)給出兩條引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod計(jì)算，會(huì)比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中還給出引物的DeltaG和3'端的DeltaGo3'端的DeltaG過高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，最好不要超過9oAnalyze中第二項(xiàng)為DuplexFormation,即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇Upper/Lower,即上下游引物之間的二聚體形成情況。弓I物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素，因此應(yīng)該避免設(shè)計(jì)的引物存在二聚體，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其DeltaG值應(yīng)該偏低，一般不要使其超過4.5kcal/mol,結(jié)合堿基對(duì)不要超過3個(gè)。Oligo此項(xiàng)的分析窗口中分別給出了3'端和整個(gè)引物的二聚體圖示和DeltaG值。Analyze中第三項(xiàng)為HairpinFormation,即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析?？梢赃x擇上游或者下游引物，同樣，DeltaG值不要超過4.5kcal/mol,堿基對(duì)不要超過3個(gè)。Analyze中第四項(xiàng)為CompositionandTm,會(huì)給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個(gè)堿基的組成比例和Tm值。上下游引物的GC%需要控制在40%?60%，而且上下游引物之間的GC%不要相差太大°Tm值共有3個(gè),分別采用三種方法計(jì)算