文檔轉基因大豆

一、國外轉基因大豆新品種培育研發(fā)的基本流程以現有大豆品種作為受體材料，利用基因工程手段，構建重組植物表達載體，用農桿菌介導法和基因槍法兩種方法將目的基因導入大豆，獲得轉基因植株，分析其對疫霉根腐病的抗病性，篩選出抗病大豆新株(品)系。由于根癌農桿菌介導的轉基因技術體系具有插入基因拷貝數低、遺傳穩(wěn)定、轉化過程相對簡單、成本相對低廉等諸多優(yōu)點，一直是植物轉基因研究的首選技術，在大豆中亦是如此。自Hinchee等于1988年建立根癌農桿菌介導的大豆子葉節(jié)器官發(fā)生轉化系統(tǒng)之后，許多實驗室以此為基礎開展了優(yōu)化、改進工作和轉基因材料創(chuàng)制研究，也使該技術體系成為了最為重要的大豆轉基因手段。在根癌農桿菌介導的大豆轉基因技術體系建立的同時，基因槍介導的大豆轉基因技術體系也獲得了成功。盡管基因槍介導的轉基因技術體系存在多拷貝插入頻率高、斷裂的DNA片段插入難以避免、轉基因后代遺傳穩(wěn)定性較差等缺點，但由于其受基因型限制較小，操作流程相對簡單、遺傳轉化相對較易實現等優(yōu)點，仍是植物轉基因研究的重要手段之一。在大豆遺傳轉化較為困難的現實條件下，其在大豆中的使用依然較為普遍，特別是在利用轉基因大豆材料進行基因功能分析的研究中更為常見。

二、如何有效減少轉基因后代材料中目的基因沉默或丟失的現象1、避免基因間的同源性由于重復或同源序列是基因沉默的普遍誘因，因此，在構建表達載體時，盡量降低所設計的序列與內源基因的同源性，以減少或避免配對。應盡量使外源DNA堿基組成與植物DNA堿基組成相一致，以避免被植物限制修飾機制所識別。同時，也可以采用定點插入方法，將外源基因插入到具有與其相似堿基組成的染色體區(qū)域。另外，在育種過程中要選擇外源基因表達穩(wěn)定的株系。2、避免重復序列的出現基因槍法以及電激法等直接DNA導入法易引起多個拷貝基因整合，使用根癌農桿菌介導法轉化植物可在一定程度上避免這一問題。因此在進行植物轉化時，應優(yōu)先考慮使用后一方法。同時，在篩選作為育種材料的轉基因植株時，應盡量選擇單拷貝插入的個體，來減少重復序列的存在。3、消除甲基化的影響鑒于轉基因甲基化程度與轉基因沉默的程度成正相關，即甲基化是基因沉默的直接原因。在載體上加上有去甲基化功能的序列以防止甲基化。如目前已知用5-氮胞嘧啶處理植株具有很好的抑制甲基化和脫甲基化作用。但由于其價格昂貴，兼有致癌性，因此實用價值不高。4、MAR的使用使用核基質結合區(qū)（matrixattachmentregion,MAR）序列是克服外源基因沉默的有效方法。MAR是染色質上的一段DNA序列，又稱之為核骨架結合區(qū)(scaffordattachmentregion)。把MAR構建到外源基因的兩側，使它們在轉基因植物的染色質中形成獨立的區(qū)域，這樣不但可以避免外源基因表達位置效應的影響，而且還可以提高外源基因在轉化細胞中的穩(wěn)定性和表達水平。5、使用誘導型啟動子大多數的科研工作都是使用組成型強啟動子，不過誘導型的啟動子迄今僅在少數植物中獲得了轉基因植株。如用于雙子葉植物轉化的花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子或胭脂氨酸合成酶nos啟動子。三、目前國內外研發(fā)機構主要采用的大豆遺傳轉化方法及其優(yōu)缺點目前大豆遺傳轉化的方法較多，主要有農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法、PEG法、顯微注射法、電激法、超聲波輔助農桿菌轉化法等，其中常用的方法有農桿菌介導法、基因槍法和花粉管通道法。1、農桿菌介導法農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，該細菌能夠在自然條件下有趨化性的感染大多數雙子葉植物的傷口部位，并能夠誘導其產生冠癭瘤或發(fā)狀根。農桿菌介導法(Agrobacterium-mediated)中應用的主要有根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)方向。3、安全性評價應用轉基因作物具有極大的經濟效益的同時，也存在一定的風險，包括對環(huán)境、食品的安全性、抗性基因的穩(wěn)定性及抗性雜草發(fā)生影響等。大豆是人類可食用的最重要的植物蛋白質之一。由于轉基因大豆安全性存在不可預見性，因此，必須要對其進行長期監(jiān)控。每一種新研制的轉基因大豆都必須通過個案處理，評估其可能存在的風險，以確保進行環(huán)境釋放和市場釋放時轉基因作物及其加工的食品具有高度的安全性。六、目前我國轉基因大豆研發(fā)中存在的關鍵問題及其解決措施大豆遺傳轉化技術不斷完善，根癌農桿菌介導法和基因槍法快速發(fā)展，其轉化效率不斷提高。但與其他主要作物（如水稻、玉米等）相比差距較大。根癌農桿菌介導法流程相對簡單、儀器設備便宜、拷貝數低，且轉基因較少沉默，可轉移基因片段較長。由于受大豆基因型、組織類型、時齡（Age）、菌液濃度和培養(yǎng)溫度等眾多因素的影響，其轉化效率較低（3%）；需要精細的人工操作，且不定芽源于多細胞，所形成的再生植株有較多的嵌合體，加大了后代的篩選難度；各個實驗室間的轉化率差距較大，重復性差，應用受到限制。而基因槍法基因沉默和拷貝數多，且其耗資大、技術難，微彈難以完全覆蓋靶組織，轉化有效性受到限制。近年來，不斷有新的方法（如花粉管導入法和晶須介導法）、新的菌種（發(fā)根農桿菌）和新的受體材料等出現，但由于方法自身特點，在大豆中的應用尚未普及。在基因克隆、載體構建和轉化方面都盡量減少選擇基因使用，如花粉