5種清熱類中藥注射液致小鼠窩淋巴結(jié)反應的比較研究

5種清熱類中藥注射液致小鼠窩淋巴結(jié)反應的比較研究

清熱中藥湯劑具有清熱明火、涼血解毒的功效，具有廣泛的藥理作用。這是大多數(shù)臨床應用的中藥湯劑（tci）。這類注射液成分復雜,大多為一些小分子化合物(lowmolecularweightcompounds,LMWC),近年來,隨著此類注射液在臨床的普遍應用,其不良反應、尤其是過敏反應的報道逐漸增多腘窩淋巴結(jié)試驗(popliteallymphnodeassay,PLNA)是至今為止被公認的唯一用來篩選LMWC致敏性及免疫毒理能力的方法。直接法(D-PLNA)和報告抗原法(RA-PLNA)在PLNA實驗研究中最為常用雖然PLNA方法不斷得到改進,但在藥物致敏潛能的初篩中,D-PLNA仍然是首選的方法,而至今未有將D-PLNA用于多種中藥注射液致敏性篩選的研究?；谝陨显?本研究以致敏物氯化汞為陽性藥,生理鹽水為陰性對照藥,利用D-PLNA對5種清熱解毒類中藥注射液(板藍根注射液、腫節(jié)風注射液、清開靈注射液、穿心蓮注射液及柴胡注射液)進行致敏性檢測,探討其潛在的致敏性。1實驗動物及儀器氯化汞(姜堰市環(huán)球試劑廠,批號20120106);牛血清白蛋白(BAS)、磷酸鹽緩沖液(PBS,批號85R12098)為北京鼎國生物試劑有限公司;柴胡注射液(開開援生制藥有限公司,批號1103141),穿心蓮注射液(麗珠利民制藥廠制藥廠,批號120311),腫節(jié)風注射液(先鋒藥業(yè),批號101010),清開靈注射液(廣州白云山明興制藥有限公司,批號110438),板藍根注射液(先鋒藥業(yè),批號100006)。TMS-F顯微鏡(美國Nikon公司),Universal320R離心機(德國Hettich公司),XP6型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司),5417R冷凍離心機(德國Eppendorf公司),CountstarIC1000自動細胞計數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司).游標卡尺(上海力成五金工具有限公司),50μl微量注射器(上海高鴿工貿(mào)有限公司)。BALB/c小鼠,雌性,SPF級,購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心,許可證號SCXK(粵)2008-0002,7~8周齡,體重(22±2)g;動物實驗環(huán)境條件:溫度(22±2)℃,濕度65%~85%,自由飲食。2小鼠骨髓細胞微核試驗雌性BALB/c小鼠按體重隨機分7組,每組10只,分別為生理鹽水組、氯化汞組、清開靈注射液組、腫節(jié)風注射液組、穿心蓮注射液組、柴胡注射液組和板藍根注射液組,氯化汞組給藥量50μg/只,生理鹽水組給予50μL/只的生理鹽水。各注射液的給藥量按人臨床最高劑量,板藍根注射液0.48mL·kg實驗第0天,固定小鼠,游標卡尺分別測量小鼠右側(cè)足跖部的厚度,用75%的乙醇棉球消毒處理小鼠足跖部,用1mL的微量注射器吸取50μL各受試物sc到小鼠右側(cè)足跖部,左側(cè)不做任何處理,之后觀察飼養(yǎng)5d。實驗第6天,脫臼處死小鼠,用75%乙醇浸泡10min,無菌操作室內(nèi)的通風柜里摘取PLN,迅速放入冰的1%BAS-PBS中,剔除多余的組織和脂肪,濾紙吸干水分,分析天平稱重,計算PLN的質(zhì)量指數(shù)(weightindex,WI=給藥側(cè)淋巴結(jié)質(zhì)量/未給藥側(cè)淋巴結(jié)質(zhì)量)。稱重后將每組一部分PLN(n=4)放入4%中性甲醛溶液中固定,經(jīng)石蠟包埋,手動輪轉(zhuǎn)切片機切片,常規(guī)HE染色,顯微鏡下觀察組織病理學變化并拍照。每組剩余PLN(n=6)稱重后迅速放在冰的1%BAS-PBS中,用來制備單細胞懸液,測定PLN的細胞指數(shù)(cellindex,CI)。將每側(cè)的淋巴結(jié)分別放在200目的不銹鋼網(wǎng)上,用注射器的內(nèi)芯輕輕研磨的同時以冰1%的BSA-PBS沖洗至小培養(yǎng)皿中,收集細胞懸液,以相對離心場2200r·min受試物引起的WI≥2和CI≥5且與對照組比較,P<0.05或P<0.01,凡差異有統(tǒng)計學意義可判斷腘窩淋巴結(jié)反應呈陽性結(jié)果數(shù)據(jù)以表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析,先進行方差分析,兩組間比較用兩獨立樣本t檢驗,實驗組與對照組采用單因素方差分析(One-WayANOVA),P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。3結(jié)果3.1各組細胞數(shù)、細胞率和單次給藥劑量對大鼠骨髓格局的影響單次足跖部sc生理鹽水對BALB/c小鼠淋巴結(jié)WI和CI沒有影響。氯化汞組、腫節(jié)風組、清開靈組、穿心蓮組各組處理側(cè)的PLN質(zhì)量和細胞計數(shù)均顯著高于對側(cè),WI和CI顯著升高,達到陽性反應標準,且與生理鹽水組處理側(cè)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01);柴胡組與板藍根組處理側(cè)PLN質(zhì)量和細胞計數(shù)較對側(cè)亦有升高,與生理鹽水組比較,WI和CI升高程度差異顯著(P<0.05),但WI和CI都未達到陽性標準。顯微鏡下觀察到各組淋巴細胞數(shù)目:與生理鹽水組相比,氯化汞組、腫節(jié)風組、清開靈組、穿心蓮組的細胞數(shù)目明顯增多;而柴胡組和板藍根組,它們的細胞數(shù)目雖有增加但未達到陽性標準。以上結(jié)果提示,腫節(jié)風注射液、清開靈注射液及穿心蓮注射液具有潛在致敏性(表1,2)。光學顯微鏡觀察可知,正常組PLN結(jié)構(gòu)皮質(zhì)與副皮質(zhì)區(qū)界線清楚,淋巴濾泡數(shù)量不多,生發(fā)中心不明顯,副皮質(zhì)區(qū)高內(nèi)皮靜脈(HEV)較小(圖1A)。陽性藥氯化汞組損傷程度最嚴重HEV橫斷面增多,其上皮呈立方形突入到血管腔中(圖1B,箭頭:HEV橫斷面)。中藥注射液腫節(jié)風組、清開靈注射液組、穿心蓮組可見不同程度的病變?nèi)缟l(fā)中心增多,組織細胞、中心母細胞部分增生,HEV橫斷面增多(圖1C,箭頭:HEV橫斷面);出現(xiàn)次級淋巴濾泡及大量組織細胞(圖1D,箭頭:組織細胞),生發(fā)中心內(nèi)含有大量中心母細胞、免疫細胞,髓質(zhì)內(nèi)組織細胞及漿細胞增多等變化(圖1E,箭頭:中心母細胞)。柴胡組和板藍根組組織結(jié)構(gòu)未見明顯變化。4d-plna法篩選D-PLNA主要是針對藥物致敏誘導階段,以局部引流淋巴結(jié)增殖為觀察終點,以淋巴結(jié)活化、增殖、分化及細胞因子和特異性抗體的分泌為觀察對象,淋巴結(jié)質(zhì)量及淋巴細胞為其檢測藥物免疫刺激能力的兩個基本指標,PLN病理圖片能清晰、直觀的反映組織的病變程度;它具有可靠、快速、操作簡單、重復性好的特點。劉兆平等采用D-PLNA法篩選雙黃連注射液的致敏成分,發(fā)現(xiàn)綠原酸本身不具致敏性本實驗結(jié)果顯示單次皮下足跖部給藥后第1天,腫脹程度最大,之后逐漸消腫。淋巴結(jié)的最佳取材時間為實驗第6~7天綜上所述,腫節(jié)風、清開靈及穿心蓮注射液有潛在的致敏性,柴胡及板藍根注射液致敏性不明顯。清熱類注射液過敏反應發(fā)生的因素有多種,雖然D-PLNA方法在中藥注射劑小分子致敏原初步、快速篩選中具有較好的應