冰凍切片實(shí)驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)：組織切片的制備點(diǎn)擊次數(shù)：350發(fā)布日期：2009-11-9來(lái)源：長(zhǎng)沙贏潤(rùn)僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)組織切片的制備二）切片方法-細(xì)節(jié)注意1切片方法的選擇光鏡和免疫組化研究的切片一般為5pm,而神經(jīng)組織切片為20-100pm,有利于追蹤神經(jīng)纖維的走行。1.1冰凍切片是免疫組織化學(xué)中最常用的一種切片方法,能夠最大量的保存抗原、操作簡(jiǎn)便,主要適用于不穩(wěn)定的抗原（如檢測(cè)細(xì)胞膜的某些抗原成分）,但標(biāo)本來(lái)源受限。冰凍切片時(shí),組織中水分易形成冰晶,影響抗原定位。冰晶小而多，對(duì)組織結(jié)構(gòu)損害大。因此可采用以下措施減少冰晶的形成：①速凍，縮短組織從-33?-43°C的時(shí)間。具體方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：將150-200ml丙酮（乙醇）裝入小保溫杯內(nèi)，逐漸加入干冰，直至飽和呈粘稠狀，再加干冰不冒氣泡時(shí)，溫度可達(dá)-70°C。用一小燒杯（50-100ml）內(nèi)裝異戊烷約50ml，再將燒杯緩慢置入干冰丙酮（乙醇）飽和液內(nèi)，至異戊烷溫度達(dá)-70C時(shí)即可使用。將組織（約1cmx0.8cmx0.5cm）t投入異戊烷內(nèi)速凍30-60S后取出，置-80C低溫保存或置恒冷冰箱內(nèi)以備切片；⑵液氮法：將組織塊平放于軟塑料瓶蓋或特制小盒內(nèi)（直徑約2cm）,如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒(méi)組織，然后將特制小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內(nèi)，當(dāng)盒底部接觸液氮時(shí)即開(kāi)始?xì)饣序v。此時(shí)小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20S組織即迅速冰結(jié)成塊。取出組織塊后立即置入-80C冰箱貯存或作恒冷切片。②將組織置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天,利用高滲吸收組織中水分，減少組織含水量。冰凍切片一般用恒冷切片機(jī)。切片后如不染色，必須將切片吹干，貯存于低溫冰箱內(nèi)，進(jìn)行短暫預(yù)固定干燥后貯存于低溫。【目的】組織標(biāo)本必須首先被制成組織切片，再經(jīng)過(guò)染色處理，然后才能在顯微鏡下進(jìn)行臨床診斷和科學(xué)研究?！驹怼刻K木素染色結(jié)合伊紅染色是常規(guī)組織學(xué)染色技術(shù)，也稱(chēng)為H&E染色。蘇木素是堿性染色，細(xì)胞核被染成深紫或蘭色，常用作核染色；伊紅是酸性染色，細(xì)胞漿染呈紅色，常用作胞漿染色?！静牧稀吭噭┖腿芤?）2-甲基丁醇（異戊醇）（2）干冰（3）O.C.T.（Tissue-Tek,SAKURA）（4）冰凍或石蠟組織塊（5）酸性Harris蘇木素染料（6）1％酸性酒精70％酒精99ml濃鹽酸1ml（7）醇溶性伊紅染料（8）酒精（9）二甲苯（10）樹(shù)脂封片液設(shè)備（1）塑料模具（2）長(zhǎng)鑷子（3）SuperfrostPlus玻片（FisherScientific）（4）蓋玻片（5）刀片（一次性或非一次性）；（6）冰凍或石蠟切片機(jī)（Leica,Micorm或其它）方法】方法1、冰凍切片的制備一、準(zhǔn)備冰凍組織用塑料或不銹鋼容器盛上2-甲基丁醇（異戊醇），然后不時(shí)放入小塊干冰，使溫度降至-40°C到-50°C,并保持低溫。標(biāo)記塑料模具并將O.C.T灌入模具，覆蓋其底部。收集組織標(biāo)本?？焖?，輕柔和準(zhǔn)確地取材以保證組織標(biāo)本的質(zhì)量，是獲得高質(zhì)量免疫標(biāo)記染色的最基本條件。將取下的組織標(biāo)本置入灌有O.C.T的模具，用O.C.T灌滿(mǎn)模具，直至標(biāo)本完全被其覆蓋。組織標(biāo)本應(yīng)盡量貼近模具底部，使標(biāo)本在切片時(shí)易于暴露。酌情調(diào)整組織標(biāo)本的位置。用長(zhǎng)鑷子挾住模具，放入冷卻了的2-甲基丁醇（異戊醇）溶液中。為了避免產(chǎn)生空泡，先將模具底部觸及溶液，盛有標(biāo)本的模具從底部開(kāi)始向表面冷凍，然后將整個(gè)模具放入溶液中5-10分鐘。（1）多數(shù)取下的組織標(biāo)本可以直接放入模具。如標(biāo)本沾有大量液體，應(yīng)當(dāng)用吸水性能好的紙沾去多余的液體，然后冷凍包埋。不要用溶液清洗標(biāo)本。（2）需要先固定處理的組織標(biāo)本，可以在完成固定后，用10％到30％蔗糖-緩沖液處理，再冷凍包埋。將凍好的組織標(biāo)本保存在-80°C冰箱以待使用。二、制作冰凍切片切片前先將冰凍組織標(biāo)本從-80°C冰箱里取出，放在冰凍切片機(jī)（-20°C）內(nèi)復(fù)溫。用O.C.T?將冰凍組織塊凍在冰凍標(biāo)本盤(pán)上，然后將其固定在切片機(jī)上。調(diào)整好組織塊平面與刀片的位置后，開(kāi)始切片。直至切到預(yù)想的部位后，開(kāi)始收集切片。根據(jù)研究目的的不同，切片可選擇不同的厚度。3-6Pm是常用的切片厚度，也可以是25-50Pm厚。切片在室溫下晾干，然后用理想的固定液固定。如果選用冷丙酮或丙酮/甲醇，切片在經(jīng)過(guò)20分鐘固定，并在室溫下晾干后，可以直接用于染色，或者將其放在密封的切片盒并存入-80°C冰箱，以待使用。余下的冰凍組織塊，可用O.C.T?覆蓋其暴露面，然后存入-80°C冰箱以待下次使用。方法2、石蠟切片的制備1．收集組織標(biāo)本并將其固定。10％福爾馬林緩沖液是最常用固定液，也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要選用其它固定液。根據(jù)標(biāo)本的大小，將其在室溫下固定8-24小時(shí)，或更長(zhǎng)。標(biāo)本的厚度以不超過(guò)3mm最佳。完成固定后，標(biāo)本即可進(jìn)行下一步的處理。2．制作石蠟組織塊需要專(zhuān)用的設(shè)備，以及復(fù)雜的組織處理過(guò)程。通常由組織學(xué)或病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。石蠟切片。準(zhǔn)備好盛有40°C蒸餾水的水浴箱，把包有組織的石蠟塊固定在石蠟切片機(jī)上，根據(jù)需要切成一定的厚度（常用4-6”m），將切片浮在水浴箱的水面上，再轉(zhuǎn)到SuperfrostPlus片子上。切片在室溫下自然風(fēng)干過(guò)夜，貯存待用。冰凍切片§§§§§§（一）冷凍切片的種類(lèi)冰凍切片的種類(lèi)較多，有低溫恒冷箱冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，甲醇循環(huán)制冷冰凍切片法等。這些方法，隨著時(shí)*代的變遷，科技的發(fā)展，許多年前被認(rèn)為是非常重要的技術(shù)，現(xiàn)在也逐步被淘汰了。當(dāng)然有些技術(shù)，如低溫恒冷箱冰凍切片法，正在受到青睞。（二）冷凍切片的目的（1）在手術(shù)進(jìn)行中，突然發(fā)現(xiàn)病人的病變與原診斷，原定手術(shù)方案不相符合，或者懷疑時(shí)，需要病理確定。（2）了解淋巴結(jié)內(nèi)是否有轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，或者轉(zhuǎn)移的程度，以利于確定是否需要徹底掃除淋巴結(jié)或者其它的治療措施。（3）對(duì)于已確定為惡性腫瘤的患者，則需要了解其手術(shù)范圍是否足夠，上下切緣是否有殘存的腫瘤組織。（4）在做剖腹探查時(shí)所發(fā)現(xiàn)的腫塊或者異樣的組織。（5）顯示組織中的脂肪和脂類(lèi)物質(zhì)，這常見(jiàn)于某些病例如脂肪瘤及肉瘤，某些科研組織等。（6）某些酶的顯示如ATP酶，琥珀酸脫氫酶等。（7）神經(jīng)病理學(xué)技術(shù)中的某些染色法如：Eager氏法，Marchi氏法，Cajal氏法，Hortega氏法和Holzer氏法等。（8）對(duì)某些物質(zhì)所進(jìn)行的免疫熒光的研究。（三）冷凍切片的制作方法（1）低溫恒冷箱冷凍切片制作法1.ShandonAs620E型恒溫箱冷凍切片機(jī)的主要性能。該機(jī)的箱面上有電子控制板，裝有即時(shí)冷凍鍵和除霜鍵，啟動(dòng)即時(shí)冷凍鍵，機(jī)器馬上進(jìn)行工作狀態(tài)，并可持續(xù)10mins。啟動(dòng)即時(shí)除霜鍵，可將工作間頂部后面的制冷柵上的霜除掉，并可持續(xù)15mins。有照明鍵一個(gè)，啟動(dòng)該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個(gè)，當(dāng)進(jìn)行一周的工作或者一天的工作后，啟動(dòng)該鍵，可對(duì)工作間進(jìn)行消毒。當(dāng)每天工作完畢時(shí)，可啟動(dòng)密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個(gè)按鍵，兩個(gè)為快速自動(dòng)進(jìn)退鍵，兩個(gè)為微小進(jìn)退鍵，還有一個(gè)手動(dòng)旋鈕，調(diào)節(jié)修組織塊時(shí)的進(jìn)退。冷凍箱內(nèi)左邊的冷凍臺(tái)，溫度可達(dá)-60°C左右，冷凍箱的中間為一臺(tái)切片機(jī)，工作間的溫度在0-30C間可任意調(diào)節(jié)，并在箱面上的熒屏顯示出來(lái)。2．操作方法及步驟：取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費(fèi)時(shí)，大者難以切完整，最好為24x24x2mm0取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺(tái)上，冰凍。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個(gè)小臺(tái)后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑0將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機(jī)持承器上，啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修平0調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在5?10um間。調(diào)好防卷板。制作冰凍切片，關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上，這就要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確地將其調(diào)較好，調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?切片時(shí)，切出的切片能在第一時(shí)間順利地通過(guò)刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上0這時(shí)便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可0應(yīng)視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據(jù)不同的組織而定，不能一概而論0如：切未經(jīng)固定的腦組織，肝組織和淋巴結(jié)時(shí)，冷凍箱中的溫度不能調(diào)太低，在-10--15°C左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時(shí)，可調(diào)在-15?20C左右，切帶脂肪的組織時(shí)，應(yīng)調(diào)至-25C左右，切含大量的脂肪時(shí)，應(yīng)調(diào)至-30C。3．冰凍切片時(shí)的注意事項(xiàng)：防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應(yīng)保持干凈，需經(jīng)常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦0有時(shí)需要每切完一張切片后就用紙擦一次0因?yàn)檫@個(gè)地方是切片通過(guò)和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘于刀或板上，將會(huì)破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出0多例多塊組織同時(shí)需做冰凍切片時(shí)，可各自放于不同的支承器上，于冷凍臺(tái)上凍起來(lái)，然后依據(jù)不同的編號(hào)，依序切片，這樣做既不費(fèi)時(shí)也不會(huì)亂0放置組織冰凍前，應(yīng)視組織的形狀及走勢(shì)來(lái)放置，所謂'砍柴看柴勢(shì)〃，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。組織塊不須經(jīng)各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達(dá)到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預(yù)先固定，一是為了爭(zhēng)取時(shí)間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會(huì)出現(xiàn)冰晶。這是因?yàn)楹墓潭ㄒ涸诮M織未經(jīng)固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當(dāng)冰凍發(fā)生時(shí)，這些水份就存留于組織中，形成了冰晶。當(dāng)切片時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)冰凍過(guò)度時(shí)，可將冰凍的組織連同支承器取出來(lái)，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來(lái)軟化組織，再行切片。另者，調(diào)高冰凍點(diǎn)。用于附貼切片的載玻片，不能存放于冷凍處，于室溫存放即可。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí)，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí)，由于兩種物質(zhì)間溫度的差別，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來(lái)附貼切片，由于溫度相同，沒(méi)有發(fā)生上述的現(xiàn)象。4．冰凍切片的快速染色法冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分鐘后即可染色。以往，為了防止切片脫落，當(dāng)切片附貼于載玻片后，即用電吹風(fēng)吹干后再固定。根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)比認(rèn)為這種做法欠妥未經(jīng)固定的切片，強(qiáng)熱作用后，蛋白發(fā)生變性，核內(nèi)含有的物質(zhì)由于熱的作用融合在一起，染色后鏡下分辨不出核內(nèi)的各種物質(zhì)。冰凍切片附貼于載玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)都在沒(méi)有任何變化的情況下被固定起來(lái)，經(jīng)一年多來(lái)1000例冰凍切片的制作實(shí)踐認(rèn)為這樣制作固定切片好，核染色質(zhì)清晰，核仁明顯，其他物質(zhì)都完好保存。方法：切片固定30秒－1分鐘。水洗。染蘇木素3－5分鐘。4.分化。5.于堿水中返藍(lán)20秒。6.伊紅染色10－20秒。7.脫水，透明，中性樹(shù)膠封固。冰凍組織1－2分鐘，切片1分鐘，固定1分鐘，染色共五分鐘?？偣苍?0分鐘內(nèi)完成快速制片過(guò)程，結(jié)果與石蠟切片不相上下。冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環(huán)的半導(dǎo)體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導(dǎo)體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法在目前來(lái)說(shuō)已很少使用，因此在這里不作闡述。腦片固定與冰切方法一戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠（50mg/kg），經(jīng)升主動(dòng)脈依次灌注生理鹽水80ml（室溫），4%多聚甲醛（0.2mol/LPB配制，pH7.4,4°C）400?500ml后，取腦，置入同種固定液后固定4h，然后浸入含30%蔗糖的0.01mol/LPBS溶液中，待腦組織下沉后，行冠狀冰凍切片（厚30“n）。每5張切片取1張，置入抗IL-6R或gp130的兔血清中，抗體工作濃度均為1：500，室溫（約30C）孵育15?20h，然后行ABC法免疫組織化學(xué)染色，用葡萄糖氧化酶-硫酸鎳銨-DAB增強(qiáng)法呈色。依次將腦切片貼于涂布有明膠鉻明礬的載玻片上，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片，鏡檢觀察。方法二動(dòng)物取材實(shí)驗(yàn)大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，灌注生理鹽水100ml待肝臟變白后，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛（含0.1%DEPC，抑制mRNA的降解）100ml至大鼠僵硬，開(kāi)顱取腦組織，固定于含4%多聚甲醛的30%蔗糖中靜置72h,待腦組織下沉后，進(jìn)行冰凍切片，厚度為20“m。連續(xù)切片，每20張取一張作原位雜交。取部分切片做HE染色。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒所附步驟進(jìn)行:①30%過(guò)氧化氫、純甲醇封閉組織抗原。②暴露mRNA核酸片段，1%多聚甲醛后固定。③預(yù)雜交，37C恒溫箱4h。④滴加雜交液，覆蓋原位雜交專(zhuān)用蓋玻片，37C恒溫箱過(guò)夜。⑤雜交后充分洗滌。⑥滴加封閉液。⑦滴加生物素化鼠抗地高辛。⑧滴加SABC。⑨滴加生物素化過(guò)氧化物酶。⑩DAB顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，顯色后充分水洗、蘇木素復(fù)染、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片.方法三動(dòng)物麻醉后，用4%多聚甲醛加0.3%飽和苦味酸混合液（pH7.2?7.4）行主動(dòng)脈灌注，取腦、小腸和膀胱置于相同固定液中8?12h（4°C）,再用含20%蔗糖上述固定液浸泡至組織塊下沉后冰凍切片（厚30nm）。方法四大鼠麻醉方法同前。首先快速灌注生理鹽水10-25m1,繼用0.375%硫化鈉1000g/ml灌注，接著予4%多聚甲醛1500ml/kg進(jìn)行內(nèi)固定，取腦，后固定18-20hr后，將腦轉(zhuǎn)移至30%蔗糖0?1mM磷酸緩沖液中72hr。待腦組織下沉后，液氮快速冷凍，冰凍冠狀切片.方法五斷頭前,經(jīng)升主蹴先灌注生理鹽爛再灌注含4%多聚甲醛和0.3%飽和苦味酸的磷酸緩沖液視馳7髓麻醉moi/L^C取腦固定2?h后姻入20%蔗糖磷酸緩沖液中至組織塊下沉‘瀧0C低溫冰箱保存驟解0.1罰廿PBS乙醚麻醉后經(jīng)左心室4%多聚甲醛溶液灌流，固定取腦。。經(jīng)4%多聚甲?液后固定電腦后級(jí)于20%DeP閽處理叡糖溶液謹(jǐn)置;換肚夜coCT（sak?aFineiHnicaic審嘩透包埋,冰凍冠裝切片，切片厚度18冊(cè)石方法砌片，備用免疫組織化學(xué)染色?！偈中g(shù)組于手術(shù)后即衢頭取腦，笛觀察組及對(duì)照組于手術(shù)后6就鉅!、48、72、96h斷頭取腦，，OCT包埋后-70C保存/冰凍切片機(jī)切取10^瓷厚冠狀切片，取海馬和皮層區(qū)進(jìn)行原位雜交檢測(cè)冰凍切片，厚20呵個(gè)定液固原位雜交組織制備1．切取的組織PBS洗滌；4%多聚甲醛/0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.4在4C固定組織1-3hrs。避免固定過(guò)夜，如果固定過(guò)長(zhǎng)可能引起組織附著在載玻片上的問(wèn)題;組織浸入無(wú)菌15%蔗糖/1XPBS中3hrs。到4C過(guò)夜;組織塊沉底.用OCT包埋冰組織塊冷凍在液氮中，把組織包埋塊的1/3（大約）放入液氮中直到包埋劑OCT的中心完全凍結(jié)，包埋塊上出現(xiàn)干冰冰組織放入密閉容器中或用錫箔包住貯存于一70C。如果不能用多聚甲醛/蔗糖法，還可以采用冷凍新鮮組織用于原位雜交。組織也要用PBS洗滌，OCT冷凍包埋組織塊。上述方法雖然不夠理想但沒(méi)有模型也能速凍組織。固定劑蔗糖和OCT步驟的應(yīng)用主要是為了改善組織形態(tài)。上述固定時(shí)間不能完全徹底固定大塊組織，然而在原位雜交步驟開(kāi)始時(shí)有附加固定步驟確保雜交前組織充分固定。此方法用于大（1cm3）和?。ǖ?mm3）組織樣品是成功的。原位雜交標(biāo)本的處理注意：RNA酶存在時(shí)很不穩(wěn)定。RNA酶是無(wú)所不在的，皮膚上，物體的表面。要是用干凈的沒(méi)有處及的玻璃器皿，尤其是試劑保存瓶，DPC-處理水溶液和70%酒精可滅活此酶。4%多聚甲醛混合于2000ml燒瓶中：200ml0.5M磷酸鈉（NaPO4）pH7.4800mlDEPC-H2O將液體加熱到70°C加入40g多聚甲醛（EMgrade,Polysciences,CatNo.0380）加熱4-5min液體會(huì)變清亮，過(guò)濾后及時(shí)裝入1000ml瓶中，迅速用冰冷卻液體防止多聚甲醛分解。4°C可保存兩周。15%蔗糖PBS配制500ml滅菌PBS75g無(wú)RN酶（RNasefree）蔗糖試劑混合后用一次性小型Nalgen過(guò)濾器（0.45um）除菌。4C保存。組織里面有水就會(huì)有冰晶。不速凍，內(nèi)外的結(jié)構(gòu)就不均一，容易產(chǎn)生形變。是的，具體操作看說(shuō)明。張敬敬知道的。像煎魚(yú)，泡沫盒底放點(diǎn)液氮，包埋盒的1/3深，用鑷子平平放下去，從下往上凍牢固，有的說(shuō)10分鐘，反正要凍透。能做到你上次作的那樣，片子不擦破，就可以了。小泡泡可以拍得時(shí)候放大倍數(shù)小一點(diǎn)。我昨天收集了很多做冰凍切片的方法，做了比較。明天OCT包埋和液氮速凍的方法注意看一下。蔗糖沒(méi)有泡到沉底，即組織內(nèi)所有的水分都被蔗糖溶液替代，是產(chǎn)生空洞的原因之一；還一個(gè)就是沒(méi)有液氮凍，液氮凍過(guò)，組織內(nèi)部的結(jié)果就致密均一了。（二）