基因工程制藥-基因表達(dá)

基因工程制藥

生技一班

20111341031028

王曉思

1.概述2.基因工程藥物的生產(chǎn)過程3.受體菌的選擇及分類4.重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞

4.1外源基因?qū)朐思?xì)胞的方法

4.2外源基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法5.基因表達(dá)5.1表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)比較

5.2大腸桿菌體系中的基因表達(dá)

5.23酵母體系中的基因表達(dá)

1.概述定義：基因工程技術(shù)是指將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建為工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)?；蚬こ碳夹g(shù)的核心是基因表達(dá)技術(shù)1973年，美國斯坦福大學(xué)的Cohen和Boyer等人在體外構(gòu)建出含有四環(huán)素和鏈霉素兩個抗性基因的重組質(zhì)粒分子，將之導(dǎo)入大腸桿菌，該重組質(zhì)粒的以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞相應(yīng)的抗生素抗性。

使得外源基因第一次表達(dá)1972年Berg和Jackson的實(shí)驗(yàn)使得重組DNA技術(shù)誕生基因工程技術(shù)最成功的應(yīng)用是用于新型生物藥物的研制DNA重組技術(shù)出現(xiàn)以前，大多數(shù)人用蛋白質(zhì)藥物從血液、尿液和動物的組織和器官中提取，成本高，產(chǎn)率、產(chǎn)量低，供應(yīng)有限，易被某些病原體污染，存在不安全因素。應(yīng)用基因工程技術(shù)：

a.可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；

b.可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質(zhì)，為臨床使用提供有效的保障；

c.利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；？？d.內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程（第二代基因工程）進(jìn)行改造；？？

e.利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源。獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌（或細(xì)胞）除菌過濾產(chǎn)物分離純化培養(yǎng)工程菌半成品檢定成品檢定包裝上游階段下游階段2.基因工程藥物的生產(chǎn)過程3.受體菌的選擇及分類a.受體菌選擇要求

①容易獲得較高濃度的細(xì)胞，培養(yǎng)條件簡單；②能利用易得廉價原料；③不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；④發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；⑤容易進(jìn)行代謝調(diào)控；⑥容易進(jìn)行DNA技術(shù)操作；⑦產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，且易提取純化。b.分類①原核細(xì)胞，常用的有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌等；②真核細(xì)胞，常用的有酵母、絲狀真菌、哺乳動物細(xì)胞等。

4.重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞4.1外源基因?qū)朐思?xì)胞（1）氯化鈣導(dǎo)入法：將大腸桿菌細(xì)胞置于冰冷的CaCl2溶中，然后瞬間加熱，外源DNA隨即轉(zhuǎn)入大腸桿菌。用氯化鈣法使大腸桿菌處于感受態(tài)，從而將外源基因?qū)爰?xì)胞，至今仍然是應(yīng)用最廣的方法。外源DNA外源DNA（2）電穿孔法：采用脈沖高壓電瞬間擊穿質(zhì)膜使外源

DNA高效導(dǎo)入細(xì)胞，現(xiàn)在采用電穿孔儀進(jìn)行。（3）λ噬菌體導(dǎo)入法：以λ噬菌體為克隆載體，可以與大的目的基因重組。這種克隆載體的好處是噬菌體本身具備感染特性，因此導(dǎo)入效率很高。Eppendorf電穿孔儀可以簡單快速的將外源DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌，酵母和其他微生物溫和噬菌體4.2外源基因?qū)胝婧思?xì)胞（1）磷酸鈣共沉淀法：利用Ca2+沉淀外源DNA（DNA上的磷酸基帶負(fù)電）沉積在細(xì)胞質(zhì)膜上而促進(jìn)吸收。（2）脂質(zhì)體法：將類脂經(jīng)超聲波、機(jī)械攪拌等處理形成雙脂層小囊泡，將外源基因包入，然后與細(xì)胞共育，類脂囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜融合而使DNA導(dǎo)入細(xì)胞。（3）脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法：用人工合成的陽離子類脂與外源DNA結(jié)合，借助類脂容易穿越脂膜的特性將DNA導(dǎo)入。（4）基因槍（高速微彈發(fā)射裝置）：用直徑1微米左右的惰性重金屬粉作為微彈，如鎢粉或金粉，其上沾有DNA，置于檔板的凹穴內(nèi)。當(dāng)用火藥或高壓氣體發(fā)射彈頭撞擊檔板時，微彈即以極高的速度射入靶細(xì)胞，而將附著其上的外源DNA導(dǎo)入。（5）病毒導(dǎo)入：外源基因插入病毒DNA中，利用病毒的感染特性將DNA導(dǎo)入細(xì)胞。（6）……

5.外源基因表達(dá)

外源基因表達(dá)：將外源的目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。外源基因表達(dá)涉及目的基因的克隆、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯，蛋白質(zhì)產(chǎn)物的加工等過程。

基因高效表達(dá)：是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動，即剪切下一個外源基因片段，拼接到另一個基因表達(dá)體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。

原核生物和真核生物基因表達(dá)過程示意圖5.1表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)比較P21表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)主要產(chǎn)品大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)（多胞內(nèi)）遺傳背景清楚；繁殖快；成本低；表達(dá)量高（占細(xì)菌總蛋白10%-70%）缺少翻譯后修飾；易形成包涵體；沒有活性；穩(wěn)定性差；大腸桿菌本身含有內(nèi)毒素和有毒蛋白；產(chǎn)生免疫反應(yīng)干擾素、白細(xì)胞介素、生長激素、成纖維細(xì)胞生長因子等酵母表達(dá)系統(tǒng)（多胞外）遺傳背景清楚；表達(dá)產(chǎn)物可糖基化、可分泌表達(dá)；易分離純化；繁殖快；毒性比細(xì)菌小；安全可靠；蛋白較穩(wěn)定表達(dá)量低；產(chǎn)物不均一；糖基化模式與天然糖蛋白存在差異；半衰期短胰島素、胰高血糖素、乙肝疫苗等哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能有效識別蛋白合成、加工和分泌信號；可對蛋白分子進(jìn)行糖基化；蛋白穩(wěn)定性好產(chǎn)率低；成本高；有些糖基化不穩(wěn)定；上游構(gòu)建及培養(yǎng)技術(shù)高干擾素、凝血因子、抗體等5.2大腸桿菌體系中的基因表達(dá)⑶應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)載體必須具備條件：⑴載體能夠獨(dú)立復(fù)制（嚴(yán)謹(jǐn)性？松弛型？）⑵應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。（pBV220、pET系統(tǒng)）⑷應(yīng)具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。⑸應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子，只轉(zhuǎn)錄克隆的基因，所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉(zhuǎn)錄后順利翻譯。影響目的基因表達(dá)的因素外源基因的劑量(2)外源基因的表達(dá)效率：①啟動子的強(qiáng)弱②核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性③SD