波漢牛胚胎移植技術(shù)的研究

波漢牛胚胎移植技術(shù)的研究

胚胎移植（et）是現(xiàn)代動(dòng)物育種領(lǐng)域發(fā)展相對(duì)完善的生物技術(shù)。適用于繁殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)，加速繁殖和繁殖速度，縮短世代間距，提高優(yōu)良品種的普及，改善后代的性能，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)水平。波爾山羊(BoerGoat)是當(dāng)今世界上優(yōu)秀的肉用山羊之一,以其產(chǎn)肉多、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適應(yīng)性強(qiáng)而倍受歡迎,自上世紀(jì)90年代引進(jìn)中國(guó)以來(lái),有力地促進(jìn)了我國(guó)肉羊產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程,尤其是胚胎移植技術(shù)在波爾山羊純種繁育上的應(yīng)用,縮短了我國(guó)與先進(jìn)國(guó)家在此領(lǐng)域的差距。胚胎移植效果受供體超數(shù)排卵、發(fā)情同期化水平、季節(jié)、采胚方法、飼養(yǎng)管理水平等因素的制約。本文對(duì)影響供體超數(shù)排卵和受體受胎率的主要因素進(jìn)行了分析,與同仁共商。1影響人體的因素分析超數(shù)排卵是胚胎移植最重要的技術(shù)環(huán)節(jié),能為科研和生產(chǎn)提供大量的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞和胚胎。超數(shù)排卵效果受激素、個(gè)體、環(huán)境等因素的影響。1.1超排效果比較用于超數(shù)排卵的激素主要有FSH(促卵泡素)、PMSG(孕馬血清促性腺激素)、LH(促黃體素)、HCG(絨毛膜促性腺激素)等。不同的處理方案、不同生產(chǎn)廠家、不同劑量均會(huì)影響超數(shù)排卵效果。生產(chǎn)上常采用FSH遞減法。國(guó)內(nèi)FSH的生產(chǎn)廠家主要有寧波市激素制品廠、中國(guó)農(nóng)科院畜牧研究所、中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所等。張鎖林用寧波激素廠FSH對(duì)66頭波爾山羊采取遞減法分4組按不同劑量進(jìn)行超數(shù)排卵,在同期化發(fā)情處理后第10～12天肌肉注射FSH連續(xù)3天,每天早晚各1次,PGF2a在最后一次注射FSH時(shí)注射。采集胚胎數(shù)分別為19.5枚(200u)、26.2枚(240u)、19.5枚(260u)、19.0枚(320u),超排效果較為理想。趙霞(2001)用寧波激素廠和中科院動(dòng)物研究所兩種FSH進(jìn)行遞減法處理,結(jié)果表明:寧波激素制品廠FSH在150u和180u劑量下都有較好的效果,兩者差異不顯著,分別采集可用胚(枚)12.85±6.99(n=85)和12.40±5.74(n=68);中科院動(dòng)物研究所FSH在3.0mg劑量時(shí)有較好的超排效果,優(yōu)于2.5mg的劑量,分別采集可用胚胎(枚)11.71±4.53(n=28)和9.32±4.83(n=25)。趙曉娥(2002)用寧波激素制品廠和中國(guó)農(nóng)科院畜牧所兩種FSH分別處理波爾山羊,第一方案用中科院FSH7.5、9.5和10.5mg3個(gè)處理,分別采集胚胎為7、11.67枚和14.25枚;第二方案為寧波FSH+農(nóng)科院畜牧所FSH,100u+5.5mg、100u+6.5mg兩種處理,分別采集胚胎13.65枚和13.25枚,兩方案均有較好的超排效果,但第二方案可降低超排成本。郭曉昭(2004)用FSH(中科院動(dòng)物研究所)和PMSG(寧波第二激素廠)進(jìn)行超數(shù)排卵試驗(yàn),于母羊發(fā)情的第9～15天,第一方案采用FSH遞減法連續(xù)3天,總量7.5mg,第二方案一次性注射PMSG100u,母羊發(fā)情后注射HCG400u,隨即配種。結(jié)果FSH處理組平均回收胚胎7.3枚,PMSG處理組平均回收胚胎5.5枚。從整體看,FSH處理組卵巢發(fā)育良好,排卵整齊,合格率高,而PMSG處理組超排效果差異較大,且有羊只出現(xiàn)卵巢囊腫。綜上所述,在生產(chǎn)中用FSH處理波爾山羊可獲得較好的超排效果,而PMSG由于半衰期較長(zhǎng),且容易引發(fā)卵巢囊腫,因此應(yīng)與FSH配合使用。寧波市激素制品廠、中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所、中國(guó)農(nóng)科院畜牧研究所三家所產(chǎn)FSH采用遞減法,在150～200u、2.5～3.0mg、7.5～9.0mg劑量時(shí)處理波爾山羊,均可獲得10枚以上的超排效果。1.2對(duì)模擬項(xiàng)目的采集法與精子角的比較在不同的時(shí)間,采用輸卵管沖胚法和子宮角沖胚法,可得到發(fā)育階段不同的胚胎,輸卵管沖胚一般在發(fā)情后的第2.5～3天進(jìn)行,可采集到2～8細(xì)胞期的胚胎;子宮角沖胚則在發(fā)情后的第5.5～6.5天進(jìn)行,可采集到從緊縮桑椹胚到擴(kuò)張囊胚期的胚胎。周占琴對(duì)波爾山羊作了子宮角與輸卵管采卵法的效果比較,發(fā)現(xiàn)利用子宮角采卵法采集到的胚胎總量及有效胚胎數(shù)低于輸卵管采集法。林峰(2005)對(duì)64只波爾山羊分別采用輸卵管采集法和子宮角采集法,發(fā)現(xiàn)輸卵管采集法的胚胎回收率明顯優(yōu)于(P<0.01)子宮角采集法,且前者的平均獲胚數(shù)與平均可用胚數(shù)均明顯高于(P<0.05)后者。但他們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)采用子宮角采集法,可用胚因胚齡較大,發(fā)育完整,質(zhì)量較好,移植受胎率較高,且生殖器官發(fā)生粘連的比例低于輸卵管法。原因是子宮角腔體大,肌肉層厚,一般不出現(xiàn)粘連,即使輕度的粘連還可在妊娠中因子宮的擴(kuò)張而得以恢復(fù)。相反,輸卵管細(xì)小,則易受損傷而發(fā)生粘連,發(fā)生粘連的部位多在輸卵管和卵巢之間,影響卵子的正常接收和運(yùn)行,甚者會(huì)導(dǎo)致不育。因此,生產(chǎn)中常采用子宮角沖胚法。1.3保乳前后受教育者超排供體年齡與超數(shù)排卵有密切的關(guān)系,在通常情況下,5.5歲以下的波爾山羊,有穩(wěn)定的超排效果,但當(dāng)年齡超5.5歲,超排效果變差。原因是老齡化的母羊情期出現(xiàn)不穩(wěn)定,卵巢機(jī)能退化,對(duì)外部激素的刺激也隨之降低。經(jīng)產(chǎn)的波爾山羊供體,超排效果優(yōu)于處女羊。趙曉娥(2002)試驗(yàn),用FSH遞減法對(duì)處女羊和經(jīng)產(chǎn)羊進(jìn)行超排,處女羊平均胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)分別為8.8枚和7.6枚,明顯低于經(jīng)產(chǎn)羊12.43枚和10.47枚的水平。張鎖林試驗(yàn)經(jīng)產(chǎn)羊平均回收胚胎16.3枚,遠(yuǎn)高于處女羊10.3枚的水平,也證實(shí)經(jīng)產(chǎn)羊超排效果優(yōu)于處女羊。供體羊的選擇,以2～5歲、1～4胎較適宜。1.4營(yíng)養(yǎng)狀況類(lèi)型種的影響供體的營(yíng)養(yǎng)狀況,尤其是超數(shù)排卵前后的營(yíng)養(yǎng)水平,對(duì)正常的發(fā)情、排卵、授精效果都有顯著的影響。楊昇試驗(yàn),將月齡相當(dāng),體重分別為>55kg、50～55kg、<50kg的波爾山羊分別定為上等、中等、下等3種營(yíng)養(yǎng)狀況,進(jìn)行相同的超排處理,結(jié)果分別獲得可用胚胎9.33、8.11和8.14枚,營(yíng)養(yǎng)狀況上等的供體可用胚數(shù)顯著優(yōu)于中、下等(P<0.01)。趙霞(2001)試驗(yàn)表明,補(bǔ)飼和不補(bǔ)飼條件下供體羊平均采集胚胎數(shù)量無(wú)顯著差異(P>0.05),但補(bǔ)飼條件下供體羊平均采集可用胚胎數(shù)量顯著高于不補(bǔ)飼(P<0.01),說(shuō)明超排前加強(qiáng)供體羊飼養(yǎng)管理明顯增加可用胚數(shù),提高超排效果。1.5第1步:外部激素的超排處理波爾山羊雖為常年發(fā)情動(dòng)物,但處于繁殖季節(jié)的卵巢活動(dòng)最為活躍,體內(nèi)的激素(主要為孕激素)水平最高,對(duì)外部激素刺激較敏感,此階段進(jìn)行超排處理,可獲得理想效果。張鎖林對(duì)波爾山羊非繁殖期與繁殖期的對(duì)比試驗(yàn)表明:在繁殖季節(jié),波爾山羊?qū)SH較敏感,卵巢發(fā)育為優(yōu)的占67.7%,遠(yuǎn)高于非繁殖季節(jié)的13.3%,同時(shí),平均獲卵數(shù)為20.7枚,顯著高于非繁殖季節(jié)的9.8枚。1.6供體母羊防惡性能批量胚胎移植時(shí),若忽視與配公羊的數(shù)量與質(zhì)量,也會(huì)影響超排效果。李紅用14只波爾山羊公羊配種135只供體母羊,結(jié)果表明,各公羊配種后超排效果存在較大差異,其中可用胚率最高達(dá)到96.4%,最低為63.3%。因此,建議在生產(chǎn)中選擇公羊時(shí),除考慮健康、體質(zhì)、性欲、精液品質(zhì)外,還需了解公羊的配種記錄,考查可用胚比率,優(yōu)先選擇可用胚率高于80%的公羊。1.7不同方法用量的混凝土超排效果波爾山羊量少價(jià)高,因此作為供體重復(fù)利用就顯得尤為重要。周占琴(2003)對(duì)32只成年波爾山羊進(jìn)行重復(fù)超排,在繁殖季節(jié),經(jīng)第一次超排處理,只均回收有效胚胎17.07枚。2個(gè)月后分A、B兩組進(jìn)行重復(fù)超排,A組FSH未加量,平均只回收胚胎12.93枚,B組FSH用量較第一次增加30%,平均只回收胚胎15.46枚,明顯高于A組。結(jié)果表明,如果方法適當(dāng),重復(fù)超排也能達(dá)到較好的超排效果。周占琴(2003)做另一試驗(yàn),采用12只2000年超排效果較好的波爾山羊,在2001年和2002年秋季進(jìn)行第二、三次重復(fù)超排,FSH用量較第一次增加30%,三次平均超排胚胎數(shù)量分別為15.50、15.83、13.40枚。結(jié)果表明,對(duì)波爾山羊進(jìn)行重復(fù)超排,適當(dāng)增加FSH用量的情況下,可以取得較理想的超排效果。但對(duì)體重較小的適齡母羊,在進(jìn)行初次超排時(shí),應(yīng)適當(dāng)降低激素的用量,以防止卵巢上濾泡的過(guò)度發(fā)育而影響供體的重復(fù)使用。生產(chǎn)中,用作重復(fù)超排的激素以FSH為最佳,有些應(yīng)用PMSG。但有資料表明,使用PMSG對(duì)同一個(gè)體進(jìn)行重復(fù)超排時(shí),會(huì)引發(fā)卵巢反應(yīng)降低,使發(fā)育的卵泡數(shù)和排卵數(shù)有所下降,最終導(dǎo)致不排卵或不產(chǎn)生成熟卵泡。FSH則無(wú)此缺點(diǎn),但兩次超排間隔應(yīng)有幾個(gè)情期,中間能妊娠一次則更好,這樣可有效消除生殖器官的粘連。2影響妊娠率的因素分析2.1發(fā)情期的調(diào)整同期發(fā)情技術(shù)是采用外源激素人為地將一群母羊的發(fā)情期進(jìn)行調(diào)整,使之能在預(yù)定的時(shí)間內(nèi)集中發(fā)情,以便于有計(jì)劃地實(shí)施胚胎移植,供、受體間及受體間發(fā)情的同期化水平是移植成功率的關(guān)鍵。2.1.1作補(bǔ)充、加害者患者的充分發(fā)揮,使取利益無(wú)規(guī)制同期發(fā)情的處理方法有多種,各方法之間同期發(fā)情有效率、發(fā)情羊排卵并形成功能黃體比率、發(fā)情持續(xù)時(shí)間都存在一定的差異,經(jīng)濟(jì)有效的處理方法,對(duì)提高移植成功率,降低移植成本,有至關(guān)重要的意義。在眾多的處理方案中,藥品以孕激素、前列腺素為主,促性腺激素起輔助作用。前列腺素具有溶黃體的功能,但對(duì)發(fā)情周期異?；蛱幱诜屈S體期的母羊則無(wú)效,因此必須有間隔在11天以上的兩次使用,方能保證較高的同期發(fā)情率。孕激素處理則能克服前列腺素的不足,且陰道栓的使用也較為方便。馬保華用3種同期發(fā)情方案對(duì)2141只(次)受體進(jìn)行處理,程序1:0天放置陰道栓(西北農(nóng)大胚胎移植試驗(yàn)室制),第11天撤栓,同時(shí)肌注FSH33u(寧波市激素廠);程序2:0天放置陰道栓,第10天肌注FSH25u,12小時(shí)后撤栓,并肌注FSH25u、PG0.1mg(上海計(jì)生所);程序3:0天肌注PG0.1mg,第6天放置陰道栓,第16天肌注FSH25u,12小時(shí)后撤栓,并第二次肌注FSH25u、PG0.1mg。結(jié)果表明:3處方案同期發(fā)情有效率分別為88.9%、91.9%和96.4%。程序3極顯著高于程序1、2(P<0.01)。供、受體羊發(fā)情同步差對(duì)受胎率有較大影響,發(fā)情同期化的實(shí)質(zhì)是排卵的同期化,排卵同期化越高,生殖器官的發(fā)育程度越相近,移植的成功率就越高。研究表明,山羊供、受體發(fā)情同步差在±24小時(shí)之內(nèi)較好,尤其以-12小時(shí)即受體羊撤栓比供體提前12小時(shí)為最佳。2.1.2不同季節(jié)和季節(jié)方法確定發(fā)發(fā)期光照是生殖活動(dòng)最原始、最重要的影響因子,山羊?qū)俣倘照談?dòng)物,發(fā)情存在明顯的季節(jié)性,如嶗山奶山羊、關(guān)中奶山羊,配種集中在9～10月份,占總配種羊數(shù)的85%以上,雷州山羊、成都麻羊等南方品種,也主要集中在8～10月份。趙永聚(2004)將316只山羊分為A、B、C、D4組,分別在春、夏、秋、冬做同期發(fā)情處理,方法為孕酮陰道栓,處理10～14天取栓,并注射PGF2a0.5mg和FSH25u,結(jié)果4組發(fā)情率分別為:72.57%、59.55%、94.74%、78.95%,以秋季最高,夏季最低;從發(fā)情開(kāi)始時(shí)間看,春、夏季處理組從取栓到出現(xiàn)發(fā)情的時(shí)間(小時(shí))分別為:43.17±19.85、46.87±17.81,顯著晚于秋、冬季的39.26±16.07和30.93±16.26;從發(fā)情持續(xù)時(shí)間看,春、夏、秋處理組分別為39.22±11.63、38.04±11.70、36.89±10.90,都長(zhǎng)于冬季的29.87±10.43。因此同期發(fā)情以秋季最好。2.2采集前后的受胎率不同胚齡的胚胎,會(huì)有不同的移植效果。周占琴采用子宮角沖胚法收集到的胚胎,移植受胎率最高可達(dá)64.3%,平均受胎率為54.7%,遠(yuǎn)高于輸卵管采集法45%的平均受胎率。楊昇研究表明,分別移植囊胚、囊胚+桑椹胚、桑椹胚不同胚齡的胚胎,受體妊娠率分別為60%、53.2%和50%。高志敏(2001)試驗(yàn),移植桑椹胚妊娠率為54.17%、囊胚為80%,也以囊胚為最高。2.3妊娠率較高的處理對(duì)同一批受體而言,移胚數(shù)的多少,影響受體的妊娠率,并決定最終產(chǎn)羔數(shù)。馬保華試驗(yàn)表明,移植1、2、3枚胚胎的受體羊,妊娠率分別達(dá)到62.73%(n=662)、70.50%(n=834)、66.85%(n=106),移植2枚胚胎的受體妊娠率高于移植1枚和3枚。檢胚時(shí),一般將胚胎分為A、B兩級(jí),其中A為優(yōu)質(zhì)胚胎,移植時(shí),可分為兩種情況來(lái)處理。一是在受體比較充裕的情況下,選擇A組胚胎進(jìn)行單胚移植,雖然妊娠率相對(duì)較低,但胚胎成羔率較高,可保證最終的產(chǎn)羔數(shù);二是胚胎數(shù)量充足而受體數(shù)量相對(duì)較少的情況下,先移植2枚質(zhì)量較好的胚胎,或A、B級(jí)胚胎按照多數(shù)1A+2B,部分2A+1B的方法搭配移植,也可獲得較高的妊娠率。雖然胚胎成羔率較移植1枚時(shí)低,但在盡可能多產(chǎn)羔的情況下,緩解了受體的數(shù)量矛盾。2.4壓藥品種的影響我國(guó)山羊品種眾多,不同品種山羊作為受體時(shí)對(duì)受胎率的影響差異研究,報(bào)道不多,但不同山羊之間生產(chǎn)性能、繁殖能力等方面有較大區(qū)別,若選擇恰當(dāng)?shù)纳窖蜃魇荏w,可能會(huì)對(duì)胚胎移植產(chǎn)生積極影響。馬保華采用雅安奶山羊、成都麻羊、間陽(yáng)大耳羊和南江黃羊等4個(gè)山羊品種作為波爾山羊移植受體。結(jié)果表明:各品種受體移植單胚時(shí)妊娠率和胚胎成羔率均無(wú)顯著差異;移植雙胚時(shí)受體妊娠率分別為69.6%、